مقدمه

پالپ دندان، بافت همبند بسیار پویائی است که به تحریکات خارجی به صورت‏های متفاوتی پاسخ
می دهد.⁽¹⁾ نقش سلول‏‏های موجود در پالپ و گردش خون بسیار بااهمیت است. سلول‏های T، حدود 70-60 درصد لنفوسیت‏های گردش خون را تشکیل می‏دهند که به زیرگروه های +CD₄و +₈CD تقسیم می‏شوند. سلول‏های TCD₄+، تحت عنوان T-helper و سلول‏‏های T CD₈⁺، تحت عنوانc T-cytotoxic  نامیده شده‏اند.⁽²⁾ اخیراً زیرگروه جدیدی از سلول‏های CD₄⁺T کشف شده‏اند، که بسیاری ازنارسایی‏‏ها و تناقضات مربوط به مدل Th₁/Th₂ را برطرف می‏سازد و با توجه به سایتوکین التهابی ویژه آن به نام IL₁₇، از آن تحت عنوان Th₁₇ یاد می‏شود. در مورد عملکرد آن که حفاظتی است یا تخریبی هنوز ابهاماتی وجود دارد. با این همه بسیاری از مطالعات، اثر تخریبی و زیانبار Th₁₇ و خصوصاً IL₁₇ را در بیماری‏های خود ایمنی التهابی آشکار ساخته اند.⁽³⁾ عملکرد اصلی IL₁₇ تقویت پاسخ ایمنی با تحریک و ترشح کموکین‏‏ها و سایتوکین‏‏ها و مارکر‏های سطح سلولی است. این اینترلوکین در آغاز و ماندگاری پاسخ ایمنی نقش محوری دارد. عامل رشدی تغییر شکل دهنده  (TGFβ)β و IL₆ برای آغاز عملکرد IL₁₇ ضروری است، در حالی که IL₂₃ باعث افزایش عملکرد IL₁₇ می‏شود.⁽⁴⁾

سلول‏های Th₁₇، سلول‏های T.helper جدیدی هستند که اخیراً شناخته شده‏اند و ارتباط نزدیکی با Th₁ در بافت‏های بیمار دارند که ممکن است مستقیماً از سلول‏های T Naïve یا Native و CD₄⁺ مشتق شده باشند.^(7-5) Th₁₇ تولید و تمایز IL₁₇را به عهده دارد. البته تمایز IL₁₇ می‏تواند از طریق IL₂₃ هم انجام شود که این IL₂₃ می‏تواند تولید IL₁₇ توسط Th₁ را نیز تحریک کند. درضمن IL₁₇ یک سایتوکین مرتبط با بیماری‏های خود ایمنی و التهابی مثل آرتریت روماتوئید و لوپوس می‏باشد.⁽⁸⁾

بیش از 20 سال پیش در سال 1989، دو دانشمند به نام‏های Mosmann و Coffman گزارش کردند که زیرگروه‏های خاصی از سلول‏های CD₄⁺ بر مبنای ترشح سایتوکین و عملکردشان وجود دارد.⁽⁹⁾ مدل Th₁-Th₂ یک پایه ساده و مفید برای درک مکانیزم‏های ایمنی در برابر عفونت‏ها ارائه می‏کند و تلاش دارد که نقش سلول‏های T را در پاتولوژی بیماری‏های اتوایمیون توضیح دهد.⁽¹⁰⁾ اخیراً شناسایی زیرگروه‏های جدید سلول T helper باعث دگرگونی دیدگاه قدیمی در رابطه با Th₁-Th₂ شده است و به توضیح روند بسیاری از بیماری‏ها و اختلالات در مدل‏های آزمایشگاهی و بالینی کمک زیادی کرده است.

تولید IL₁₇ تقریباً منحصر به T.cell‏‏های فعال شده‏ای است که نام آنها Th₁₇ می‏باشد و مجزا از Th₁ و Th₂ است.^(11و5) سلول‏های Th₁₇ در پاتوژنز بیماری‏های اتوایمیون ارگان‏های خاص نقش دارند. همچنین در ایمنی علیه عفونت از طریق به کارگیری نوتروفیل‏‏ها در محل عفونت و فعال کردن ماکروفاژها، نقش ایفا می‏کنند.^(13و12) IL₁₇ اگرچه در ابتدا توسط T.cell‏‏ها تولید می‏شود، اما یک سایتوکین پیش التهابی (Proinflammatoy) با قدرت اثر بر سلول‏های گوناگون از سیستم ایمنی ذاتی خصوصاً رده گرانولوسیت‏ها نیز می‏باشد. بنابراین IL₁₇ یک مولکول متصل کننده سیستم ایمنی ذاتی به سیستم ایمنی اکتسابی محسوب می‏شود.^(14و8) باتوجه به مطالب ذکر شده در این مطالعه، به بررسی وجود IL₁₇ در پالپ سالم و علامت‏دار پرداخته شد که می‏تواند راهگشای نکاتی از تحقیقات پایه باشد. به علاوه ممکن است با استفاده از نتایج این پژوهش، بتوان نسبت به تسکین، کنترل یا احیاناً درمان دارویی التهابات پالپی، اقدامات موثرتری انجام داد.

مواد و روش‏ها

در این مطالعه توصیفی-تحلیلی، پالپ دندان‏های مولر سوم نهفته جراحی شده از بیماران مراجعه کننده به کلینیک تامین اجتماعی اصفهان به عنوان گروه کنترل در نظر گرفته شد و پالپ دندان‏‏های مولر یا پرمولر پوسیده بیماران مراجعه کننده به کلینیک حضرت محمد (ص) اصفهان به عنوان گروه آزمایش انتخاب شدند.

معیار‏های ورود و خروج نمونه‏ها: تنها دندان‏‏های کاملا سالم، بدون پوسیدگی، بدون علامت و فاقد هرگونه ضایعه پری اپیکال یا پریودونتال در گروه کنترل شرکت داده شدند. همچنین دندان‏های گروه آزمایش دارای تاریخچه درد متناوب تیز به محرک‏های حرارتی، پاسخ تاخیری دردناک به محرک‏های سرما، وجود پوسیدگی اکسپوز شده، عدم وجود ضایعه پری‏اپیکال و پریودونتال و پاسخ به پالپ تستر الکتریکی (EPT) بودند.

نمونه گیری در این مطالعه به صورت آسان انجام شد. حجم نمونه نیز بر اساس مطالعات قبلی و مشاوره آماری انجام شد (20 نمونه در هر گروه).

نمونه‏‏های کنترل مورد نیاز از پالپ دندان‏های مولر سوم نهفته افرادی که برای قبل از کشیدن دندان‏های گروه آزمایش و گروه کنترل پرونده‏ای برای بیماران تهیه شد که در آن اطلاعاتی شامل مشخصات فردی، تاریخچه پزشکی، تست‏های حیاتی و حساسیت به دق و یافته‏‏های رادیوگرافیک ذکر شده بود.

نمونه پرونده مورد استفاده در طرح

برای خارج کردن بافت پالپ از دندان‏های گروه کنترل و گروه آزمایش، پس از کشیدن دندان، در ابتدا توسط توربین (با فرز کارباید 557 High speed با آب فراوان) دو برش طولی در مقابل هم روی تاج دندان ایجاد شد. این شیار‏های طولی روی ریشه یا ریشه‏‏های دندان نیز امتداد پیدا می‏کرد تا بهتر بتوان پالپ را کامل و بدون پارگی در محیط استریل خارج نمود. سپس توسط الواتوری که در شیار ایجاد شده قرار می‏گرفت و با فشار متعادل، دندان به دو قسمت شکسته می‏شد و بلافاصله بافت پالپی توسط پنس خارج شده و در ظروف مخصوص شیشه‏ای حاوی فرمالین که شماره پرونده مربوط به هر دندان روی آن ثبت شده بود گذاشته می‏شد. همه این نمونه‏ها در مدت کمتر از 24 ساعت، جهت آماده سازی بافتی به آزمایشگاه فرستاده می‏شدند. در این تحقیق، جهت بررسی وجود IL₁₇ در پالپ دندان‏‏های طبیعی و علامت‏دار، از تکنیک ایمونوهیستوشیمی استفاده گردید.

تکنیک ایمونوهیستوشیمی به منظور تشخیص وجود آنتی ژن‏های خاص در بافت‏های مورد مطالعه کاربرد دارد و اساس آن نشان دادن واکنش آنتی بادی علیه آنتی ژن‏های ویژه به کمک مواد رنگی است. در این مطالعه از تکنیک ایمونوهیستوشیمی Biotin- streptavidin Novolink polymer Detection system به علت حساسیت و دقت بالای آن نسبت به سایر روش‏ها استفاده شد.

آنتی بادی‏های پلی کلونال Rabbit علیه IL₁₇ انسانی اولیه در رقت 100/1 به عنوان آنتی بادی اولیه استفاده شد. برش‏ها تهیه شده و با استفاده از کیت Biotin- streptavidin Novolink polymer Detection system. مطابق با دستور کارخانه سازنده رنگ‏آمیزی شدند.

روی لام شارژ شده با پلی الایزین از بلوک مورد نظر مقاطعی به ضخامت 4-3 میکرون روی لام شارژ شده با پلی الایزین تهیه شد. سپس لام‏‏ها به مدت40 دقیقه در فور 60-58 درجه سانتیگراد قرار داده شد و بعد از آن، در سه تغییر گزیلول هر یک به مدت 5 دقیقه قرار داده شد تا پارافین زدایی شوند ((Deparaffinization. جهت آب دهی مجدد (Rehydration) بافت‏ها از الک‏های درجه بندی نزولی یعنی از درجه غلظت بیشتر به کمتر به ترتیب 75، 85، 95، 100، 100 و سپس آب مقطر استفاده شد. در مرحله بعد، با استفاده از بافر سیترات با PH=6 و حرارت مایکروویوناسیونال W 700 با دمای c°95 -92 به مدت 20-15 دقیقه عمل بازآوری آنتی ژنی Antigen retrieval)) انجام شد تا ساختمان مولکولی آنتی ژن هایی که در اثر فیکساسیون تغییر شکل یافته بودند توسط حرارت به حالت طبیعی برگردند که البته این عمل با توجه به بروشور آنتی بادی و تجربه کارشناس مربوطه انجام گردید. در مراحل بعدی، ابتدا لام‏‏ها به مدت 20 دقیقه در دمای اتاق سرد شدند و سپس در آب مقطر شستشو داده شدند. سپس لام‏‏ها به مدت 5 دقیقه به PBS یا (Phosphate buffer saline) منتقل شدند. سرانجام لام‏‏ها به مدت 5 دقیقه در محلول بلوکینگ هیدروژن پراکسیداز 3% به منظور غیرفعال کردن پراکسیداز درون زا و بعد از آن به مدت 5 دقیقه در آب مقطر و سپس 5 دقیقه در PBS قرار داده شدند. در مرحله بعد، لام‏‏ها در محلول Protein Block NoVo castra ساخت کشور آلمان به مدت 5 دقیقه غوطه‏ور گردیدند. بدون شستشوی لام‏ها فقط محلول Blocking روی آنها تخلیه شده و سپس جهت بررسی حضور سایتوکین IL₁₇ به مدت یک ساعت در محلول .IL₁₇ monoclonal antibody clone TCLL-181110-1Santa Cruze (ساخت کشور آمریکا) که آنتی بادی اولیه بود، قرار گرفتند تا آنتی بادی به آنتی ژن مورد نظر متصل شود. لام‏‏ها با آنتی بادی اولیه IL₁₇ به مدت یک ساعت و غلظت 50/1 انکوبه شدند که زمان و غلظت آنتی بادی و دما با توجه به بروشور مربوطه انتخاب گردید. بعد از شستشوی لام‏‏ها با PBS به مدت 5 دقیقه، اسلاید‏ها در Post primary Block (RE 7111) برای 30 دقیقه انکوبه شدند. سپس لام‏‏ها به مدت 30 دقیقه در Novolink Polymer (RE 7112) انکوبه شدند. قبل و بعد از انکوباسیون اسلاید‏ها به مدت 5 دقیقه در PBS شستشو داده شدند.

به یک میلی لیتر از بافر Novolink DAB Substrate (RE 7143)، 50 میکرولیتر کروموژن DAB اضافه شد تا محلول DAB به دست آید که پایداری آن حداکثر 6 ساعت است. سپس لام‏‏ها به مدت 5 دقیقه با محلول DAB ساخته شده انکوبه شدند و بعد از آن، جهت رنگ‏آمیزی زمینه در هماتوکسلین مایر (RE 7107) برای 5 دقیقه قرار داده شد. پس از آن، شستشو داده شده خشک شدند و شفاف سازی در گزیلول صورت گرفت و نهایتاً لام‏ها مانت گردیدند. محلول Novolink polymer در مقایسه با روش بیوتین استرپتو آویدین، جایگاه‏های بیشتری برای واکنش دارد و باعث بروز افزایش دقت و حساسیت می‏گردد. نهایتاً اگر آنتی ژن مورد نظر در بافت وجود داشته باشد به رنگ قهوه‏ای مشاهده می‏شود.

برای کنترل آزمایش‏‏های انجام شده، از شاهد‏های کنترل مثبت و منفی استفاده شد. شاهد مثبت، نمونه مثبت تیپیک و شاهد منفی، نمونه منفی تیپیک رنگ شده بودند.

بررسی و ارزیابی نمونه‏‏های ‏های مورد مطالعه با میکروسکوپ نوری Olympus ساخت ژاپن با بزرگنمایی 100 و 400 برابر انجام شد. به این صورت که ابتدا کیفیت رنگ‏آمیزی هماتوکسیلین ائوزین (H&E) نمونه‏‏ها توسط آسیب شناس تائید گردیده و سپس لام‏ها باتکنیک ایمونوهیستوشیمی رنگ‏آمیزی گردیدند و توسط متخصص آسیب شناس دهان، فک و صورت مورد ارزیابی قرارگرفت. رنگ‏پذیری سلول‏ها در کلیه نمونه‏‏ها شامل هسته و سیتوپلاسم سلول‏ها بود. ضمن اینکه فقط هسته‏هایی رنگ‏پذیری شان مثبت تلقی شد که رنگ‏پذیری واضحی داشتند. نتایج شمارش سلولی برای هر نشانگر به شکلی کمی و به صورت (Labeling Index) LI بیان شد و برای هر یک از نمونه‏‏ها Staining Intensity Distribution (SID) تعریف شد.

مجاورات نمونه مشخص شد، به طوری که نمونه در مرکز یک فاصله از بافت اطراف قرار گرفت. نواحی که در معرض شمارش سلول بودند مشخص شدند. مشاهده لام‏ها زیر میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی 100 و 400 برابر توسط پاتولوژیست دهان، فک و صورت به صورت تصادفی در مناطق بصری انجام شد و شمارش سلول‏ها مطابق با طرح ثابت یک سوکور (Single blind) در 5 میدان میکروسکوپی انجام گرفت. سپس تعداد سلول‏های Antibody reavctive در هر hpf (Cell/hpf) مورد شمارش قرار گرفتند و درصد متوسط فراوانی سلول‏‏های رنگ گرفته و نیز شدت متوسط سلول‏‏های رنگ گرفته مشخص گردید (تصاویر 1 و 2).

در بررسی نمونه‏‏ها به روش ایمونوهیستوشیمی می‏توان توسط SID Score نتایج کیفی را به صورت کمی براساس زیر مورد آنالیز قرار داد. این معیار عبارت است از حاصل ضرب فراوانی (Distribution) در شدت (Intensity)  رنگ‏پذیری سلول‏‏های رنگ گرفته.

برای تعیین فراوانی سلول‏‏های رنگ گرفته، از معیار‏های زیر استفاده شد:

-       عدم رنگ‏پذیری با عدد صفر (0)

-       رنگ‏پذیری کم تر از 25% با عدد یک مثبت (+1)

-       بین 25 تا 50 درصد با عدد دو مثبت (+2)

-       بین 50 تا 75 درصد با عدد سه مثبت (+3)

-       بیش از 75 درصد با عدد چهار مثبت (+4) نشان داده شدند

برای تعیین شدت رنگ‏پذیری سلول‏‏های رنگ گرفته،

-       عدم رنگ‏پذیری با عدد صفر (0)

-       رنگ‏پذیری کم (Light) با عدد یک مثبت(+1)

-       رنگ‏پذیری متوسط (Moderate) با عدد دو مثبت (+2)

-       رنگ‏پذیری شدید (High) با عدد سه مثبت(+3)

-       رنگ‏پذیری بسیار شدید با عدد چهار مثبت (+4)

بررسی کمی و کیفی رنگ‏پذیری نشانگر‏های ایمونوهیستوشیمی مربوط به سایتوکین IL₁₇ که به صورت شاخص SID یا SID Score تعریف شده بودند توسط نرم‏افزار SPSS با ویرایش 17 و انجام آزمون آماری Mann-Whitney انجام شد. سطح معنی‏داری 05/0=α در نظر گرفته شد.

یافته‏‏ها

بررسی شاخص SID در توزیع فراوانی IL₁₇ در مقایسه بافت‏های پالپی علامت‏دار (353/1 ±40/2) با نمونه‏‏های سالم و نرمال (933/0±15/1) اختلاف آماری معنی‏داری را نشان داد (002/0P=)

بررسی وجود IL₁₇ در نمونه‏‏های پالپی سالم (عقل نهفته) و دندان‏های علامت‏دار نشان داد که SID آنها اختلاف آماری معنی‏داری با هم دارند (05/0P<) به طوری که در پالپ دندان‏های ملتهب علامت‏دار این میزان بیشتر بود (جدول 1).

جدول 1 : توزیع فراوانی میزان SID در دو گروه مورد پژوهش

تصویر 1 : نمای میکروسکوپی بروز سایتوکین IL₁₇ در نمونه پالپیت با بزرگنمایی 400 برابر. در این نمونه توزیع فراوانی معادل 2و شدت رنگ‏پذیری3 و در نتیجه شاخص SID معادل 6 بود.

تصویر 2 : نمای میکروسکوپی عدم بروز سایتوکین IL₁₇ در نمونه پالپ نرمال با بزرگنمایی 400 برابر. در این نمونه توزیع فراوانی معادل 0 و شدت رنگ‏پذیری 0 و در نتیجه شاخص SID معادل0 بود.

در جدول 2 میانگین و انحراف معیار SID آمده است. به علاوه، در هر گروه، میانگین رتبه‏ای و انحراف معیار و میانه نیز محاسبه شد.

نمودار ستونی در مقایسه دو گروه مورد پژوهش حاکی از افزایش حدود 2 برابری IL₁₇ در گروه مورد (353/1±40/2) نسبت به گروه شاهد (933/0±15/1) می‏باشد (002/0=P) (نمودار1).

جدول 2 : شاخص‏‏های آماری مربوط به SID مربوط به دو گروه مورد پژوهش

نمودار 1 : نمودار ستونی میانگین SID درگروه شاهد و مورد