مقدمه:

سرطان معده درجهان به عنوان چهارمین سرطان شایع ودومین عامل مرگ براثرسرطان شناخته می شود (1).این سرطان از دیدگاه بافت شناسی به دو دسته ی منتشر[1] و روده ای[2]  تقسیم می گرددوجزءبیماریهای چندعاملی[3] دسته بندی می شودوعوامل عفونی،محیطی وژنتیکی به عنوان عوامل خطر برای ابتلا به سرطان معده معرفی شده اند(2).اگر سرطان معده در مراحل اولیه تشخیص داده شود احتمال درمان کامل بیمار بسیار بالاست و با توجه به این که علائم سرطان معده بسیار دیر ظاهر می گردد اهمیت کنترل و سنجش خطر بیماران بر اساس مولفه های اصلی مستعد کننده فرد حائز اهمیت می باشد.(3، 4).

سرطان معده تنوع جغرافیایی گسترده ای دارد به طوری که کشور های ژاپن، چین، کره جنوبی، آمریکای جنوبی و مرکزی بیشترین شیوع و کشور های هند، پاکستان، تایلند، شمال و غرب آفریقا و آمریکا ی شمالی کمترین شیوع را دارند (5).میزان بروز این سرطان در نواحی مختلف ایران نیز متفاوت است، به طور مثال بروز این بیماری در اردبیل 1/49 نفردر مردان و 4/25 نفردر زنان در هر 100 هزار نفر(بالاترین میزان سرطان معده در ایران) گزارش شده است، در حالی که در کرمان 2/10 نفر در مردان و 1/5 نفردر زنان در هر 100 هزار نفر برآورد شده است (6، 7). اگر چه شیوع جهانی سرطان معده به طور چشمگیری در چند دهه أخیر کاهش یافته است، اما شایع ترین سرطان در شمال و شمال غرب ایران محسوب می شود (6، 7).

در سرطان ها یکی از مواردی که مشاهده می شود تغییر در سیتواسکلتون و ترابری سلولی است(8). یکی از پروتئین هایی که در این فرآیندها نقش مهمی دارد RhoB می باشد. RhoB یک GTPaseکوچک عمدتاً اندوزومی است که سازماندهی اکتین و ترابری وزیکولی را تنظیم می کند (9).ژن RhoB در انسان بر روی کروموزوم 2 در جایگاه 2p24.1 واقع شده است. این ژن فقط دارای یک اگزون می باشد و پروتئینی به طول 196 اسید آمینه با وزن مولکولی 22123 دالتون کد می کند(10).

 علاوه بر RhoB، خانواده Rho GTPase شامل دو عضو RhoA و RhoC نیز می باشد که90 % در توالی آمینو اسیدی همسان اند. در حالی که هر یک، تشکیل فیبر استرسی اکتین را تنظیم می کنند، با این وجود،عملکردهای فیزیولوژیکی و پاتوفیزیولوژیکی متمایزی دارند که احتمالاً به دلیل تفاوت در جای گیری زیر سلولی آن ها می باشد (11). RhoB احتمالاً به عنوان یک تغییر دهنده ی منفی یا سرکوبگر ژن در سرطان عمل می کند و مورد توجه فزاینده ای قرار گرفته است (12). در تومور های جامد، میزان بیانRhoB با پیشرفت تومور کاهش می یابد  و افزایش بیان RhoB می تواند مهاجرت سلولی، تهاجم و متاستاز را مهار کند (13،14).

در سرطان معده،بیان RhoB کاهش می یابدو حتی در مواردی بیان نمی شود و همچنین مشخص شده است که بیان این ژن با مقاومت دارویی در سرطان معده نیز مرتبط است ( 15).

مطالعات قبلی نشان داده است که چند شکلی[4]درژن های دخیل درپاسخ التهابی، ترمیم DNA، آنزیم های متابولیک، آسیب اکسیداتیو وغیرهبا سرطان معده ارتباط دارد (16).یکی از انواع چندشکلی ها، توالی های تکراری پشت سر هم با تعداد متغیر(VNTR)[5] است که در سراسر ژنوم یافت می شود. VNTR های ناحیه رمز گذار ژن می توانند منجر به تغییرات در خواص بیولوژیکی پروتئین ها شوند، اما همه VNTR ها در ناحیه رمز گذار نیستند و بعضی از آنها در نواحی تنظیمی می باشند (18،17). یکی از عناصر مهم در تنظیم بیان ژن، توالی پروموتر آن می باشد و مطالعه های متعدد، حاکی از ارتباط معنی دار چند شکلی پروموتر ژن های مختلف با انواع سرطان ها است(19-22). وجود VNTR ها در نواحی تنظیمی ژن می تواند بر سطح بیان ژن اثر داشته باشد(18،17،23).

در انسان پروموتر ژن RhoB دارای یک چند شکلی VNTR است که در موقعیت 820 جفت بازی بالا دست جایگاه شروع رونویسی قرار دارد که دارای تکرار های پشت سر هم 34 جفت بازی است و بین 8-14 بار این توالی تکرار می شود. این توالی 34 جفت بازی دارای دو بخش 12 نوکلئوتیدی TTCTATTGTACA است که توسط یک بخش 10 نوکلئوتیدی ATAGTGTATA از هم جدا می شوند (24).

در ارتباط با نقش VNTR ژن RhoB بر بیان آن تنها دو مطالعه وجود دارد که نتایج آن ها متناقض است (24 ،25). با توجه به نقش RhoB در سرطان ها از جمله سرطان معده در این مطالعه برای اولین بار ارتباط تعداد تکرارهای VNTR پروموتر ژن RhoB با خطر ابتلا به سرطان معده مورد بررسی قرار گرفت و سپس نقش تعداد تکرارها بر بیان ژن RhoB نیز بررسی شد.

روش کار:

این مطالعه مورد شاهدی در سال 1393 در آزمایشگاه دانشگاه آزاد شهر کرد انجام شده است. ابتدا، با هماهنگی با بیمارستان امید اصفهان و پس از کسب رضایت نامه، از بین افراد مبتلا به سرطان معده 100 نفر به طور تصادفی انتخاب شدندکه شامل 26 زن و 74 مرد با دامنه سنی 26 -85 سال بودند. همچنین 250 فرد سالم از جمعیت عمومی شامل 149 زن و 101 مرد با دامنه سنی 21 تا 89 سال که از لحاظ سن (5± سال) و جنس با گروه بیمار همسان سازی شده اند و به منظور اهدا خون به انتقال خون مراجعه کرده بودند، به عنوان گروه کنترل (شاهد) در این مطالعه مورد بررسی قرار گرفتند. از همه افراد 5 سی سی خون گرفته شد وDNA ژنومی از نمونه خون هایی که در لوله های حاوی ماده ضد انعقاد EDTA گرفته شده بود به روش Salting out استخراج گردید(26). یک جفت پرایمر مناسب برای ناحیه ای از پروموتر ژن RhoBکه شامل VNTR می شودبااستفاده ازنرم افزار الیگو نسخه 5 طراحی گردید.توالی پرایمرهای مورد نظر5^´-CCCCTCTTCTCCAGCCTCAA-3^´(رفت) و 5^´-TTGACAACGGAAAGGGAAGGT-3^´ (برگشت) است که در صورت وجود آلل با 4 تکرار، قطعه bp 351 تکثیر می شودو به ازای اضافه شدن هر تکرار، 34 جفت باز به طول قطعه فوق اضافه خواهد شد. مواد لازم برای واکنش PCR در حجم 10 میکرولیتر شامل 5 ماکرولیتر Taq2X Master Mix Red(AMOLIQON، دانمارک)، 5/0 ماکرولیتر از هر پرایمر (pmol 5)، یک ماکرولیتر DNA ژنومی و سه ماکرولیتر آب دو بار تقطیر بود. تکنیک PCR طی مراحل دناتوراسیون اولیه در دمای 94 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه و 25 سیکل (94درجه سانتیگراد به مدت 45 ثانیه، 62 درجهسانتیگراد به مدت 30 ثانیه، 72 درجه سانتیگراد به مدت یک دقیقه) و طویل سازی نهایی در دمای 72 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه بهینه شد. سپس محصولات PCR بر روی ژل آگاروز 5/2% به مدت 65 دقیقه با ولتاژ 120 الکتروفورز شد. با رنگSafe View DNA STAIN(کیاژن، ایران) ژل رنگ آمیزی شد وبر اساس اندازه باندهای ایجاد شده، ژنوتیپ هرنمونه مشخص گردید.علاوه بر این ها،بافت معده 50 فرد سالم که برای انجام آندوسکپی به پزشک متخصص مراجعه کرده بودند، با کسب رضایت نامه شخصی برای بررسی بیان ژن RhoB مورد بررسی قرار گرفت. ابتدا DNA و RNA نمونه بافت هایی که در لوله های حاوی محلول نگهداری کننده RNA گرفته شده بود با استفاده از ترایزول استخراج گردید. سپس با استفاده از دستورالعمل کیت فرمنتاز cDNA سنتز شد وجهت بررسی صحت سنتز cDNA، برای ژن بتا اکتین RT-PCR گذاشته شد برای این منظور، پرایمرهای5^´-CGTGACATTAAGGAGAAGCTGTGC-3^´ (رفت)و 5^´-CTCAGGAGGAGCAATGATCTTGAT-3^´(برگشت)برای ژن بتا اکتین طراحی شد و سپس واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) برای جفت پرایمر، بهینه سازی شد. مواد لازم برای واکنش PCR در حجم 15 ماکرولیتر جهت تکثیر ژن بتا اکتین شامل 5 ماکرولیتر Taq2X Master Mix Red، 6/0 ماکرولیتر از جفت پرایمر(pmol 5)، 6/0 ماکرولیتر cDNAو 2/8 ماکرولیتر آب دو بار تقطیر بود.تکنیکPCR طی مراحل دناتوراسیون اولیه در دمای 94 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه، 35 سیکل (94 درجه سانتیگراد به مدت یک دقیقه، 55 درجه سانتیگراد به مدت 45 ثانیه، 72 درجه سانتیگراد به مدت 45 ثانیه) و طویل سازی نهایی در دمای 72 درجه سانتیگراد به مدت 10 دقیقه بهینه شد.سپس محصولات PCR بر روی ژل آگاروز 5/1 درصد الکتروفورز شد.حضور باند bp375 بتا اکتین نشان دهنده صحت سنتز cDNA می باشد.پس از سنتز cDNA بیان ژن RhoB با استفاده از روش RealTimeRT–PCR انجام شد.برای این منظور پرایمرهای5^´-TTGTGCCTGTCCTAGAAGTG-3^´(رفت)و5^´-CAAGTGTGGTCAGAATGCTA-3^´(برگشت)برایژن RhoBو پرایمرهای 5^´-CCACTCCTCCACCTTTGACG-3^´(رفت)و5^´-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3^´ (برگشت) برای ژنGAPDH  (به عنوان ژن رفرنس)طراحی شد. طول قطعه تکثیر شونده برای ژن RhoB،bp164 وبرای ژن GAPDH، bp 107 می شود. برای افزایش دقت کار، یک گرادیانت غلظتی برای نمونه cDNA و همچنین برای پرایمر اختصاصی (با سه غلظت 5، 5/7 و 10 پیکو مول)گذاشته شدکه بهترین غلظت برای cDNA، 5/37 نانوگرم بر ماکرولیتر و برای پرایمر،5/7 پیکو مول بود. مواد لازم برای واکنش Real TimeRT–PCR در حجم 10 ماکرولیتر برای ژن RhoB و GAPDH، شامل 5 ماکرولیتر SYBER GREEN، 6/0ماکرولیتر از هر جفت پرایمر، 75/0 ماکرولیتر cDNA و 05/3 ماکرولیتر آب DEPS بود. تکنیک Real TimeRT–PCR طی مراحل دناتوراسیون اولیه در دمای 95 درجه سانتیگراد به مدت سه دقیقه به عنوان مرحله یک و در مرحله دوم در دمای 95 درجه سانتیگراد به مدت 5 ثانیه، 55 درجه سانتیگراد به مدت 20 ثانیه و 72 درجه سانتیگراد به مدت 10 ثانیه و در مرحله Melting Curve در دمای 95 درجه سانتیگراد به مدت 15 ثانیه، 60 درجه سانتیگراد به مدت یک دقیقه و 95 درجه سانتیگراد به مدت 15 ثانیه بهینه شد.برای تمام نمونه های مورد بررسی،Real Time RT-PCR به صورت دو بار تکرار انجام شد و بیان ژنRhoB و ژن رفرنس(GAPDH)در افراد مختلف، مورد بررسی قرار گرفت.علاوه بر این برای نمونه های بافتی،ژنوتیپ VNTR با همان روشی که قبلا اشاره شد، تعیین گردید.

تجزیه و تحلیل داده ها:

 تجزیه و تحلیل آنالیزنتایج حاصل از نمونه های خون با استفاده از نرم افزار آماریSPSS  و آزمون های آماری رگرسیون لجستیک و ²X انجام شد. علاوه بر این برای آنالیز نتایج نمونه های بافتی از روش آماری تی تست [6]آزمون دو طرفه (2-tail)، استفاده شد. سطح معناداری در این آنالیز، 0.05 در نظر گرفته شد.

نتایج:

پس از الکتروفورز محصولات PCR نمونه های خون،انواع باندهای مختلف که نشان دهنده آلل های مختلف می باشد مشاهده شد که نمونه هایی از نتایج حاصل در شکل 1 مشاهده می شود.(شکل 1)