لیشمانیوز احشائی (کالاآزار) یا بیماری سیاه یک بیماری انگلی است که توسط گونه های مختلفی از تک یاخته ای به نام لیشمانیا ایجاد می شود و با علائم تب های طولانی، کم خونی، بزرگی طحال و کبد و تورم غدد لنفاوی و لاغری همراه است. این بیماری یک بیماری بالقوه کشنده است که در همه نقاط جهان قابل مشاهده است و در آن عامل بیماری و ناقل آن بسته به منطقه جغرافیایی متفاوت می باشد (1).

لیشمانیوز احشائی در خاورمیانه و در برخی مناطق ایران به صورت آندمیک و در برخی مناطق به صورت انفرادی وجود دارد. این بیماری سالانه تعداد زیادی از افراد را که اکثر آن ها کودک می باشند، مبتلا می کند.کالاآزار انواع مختلفی دارد که نوع مدیترانه ای آن در ایران شایع می باشد (2). کالاآزار نوع مدیترانه ای در کشورهای اطراف مدیترانه، جنوب اروپا، شمال آفریقا، خاور میانه، کشورهای قفقاز و آسیای مرکزی گزارش شده است. عامل اصلی کالاآزار مدیترانه ای لیشمانیا اینفانتوم است که در برخی موارد توسط لیشمانیا تروپیکا نیز منتقل می گردد (2). لیشمانیا اینفانتوم به وسیله گونه خاصی از پشه خاکی از جنس فلبوتوموس منتقل می گردد. مخزن این انگل که بین حیوان و انسان مشترک است سگ سانان وحشی می باشند (3).

کالاآزار به عنوان یک بیماری شایع در استان خراسان شمالی خصوصا در میان عشایر شناخته شده است. با این وجود تعداد کمی از افراد آلوده علائم بارز بیماری را به صورت تب، بزرگی طحال و کبد، کم خونی، نوتروپنی و زردی نشان می دهند و اکثر افراد بدون علامت باقی می مانند (4). به علاوه، این بیماری می تواند با سایر بیماریهای خطرناک مانند عفونتهای نقص سیستم ایمنی مانند HIV همراه باشد (5).

به طور کلی، از هر 50 مورد آلودگی جدید در اثر گزش یکی منجر به کالاآزار می شود، به طوریکه عفونت بدون علامت شایع تر از کالاآزار است. برخی مطالعات نشان داده اند که حتی در مناطقی که مخزن کالاآزار سگ سانان می باشند افراد بدون علامت در زنجیره انتقال نقش دارند. بنابر این تعیین شیوع و انتشار موارد بدون علامت به شناسائی بهتر وضعیت کالاآزار و روش های کنترل کمک می کند (6, 7).

بیماری کالاآزار دارای اشکال مختلف بالینی است و ابزار های مختلفی برای تشخیص آن وجود دارد. مشاهده مستقیم آماستیگوت ها در نمونه های بالینی استاندارد طلایی تشخیصی است که نیاز به مداخله تهاجمی آسپیراسیون بافتی و نیز مهارت تکنیکی دارد (8). روش های سرولوژیک فوق العاده حساس و غیر تهاجمی می باشند. شناسایی آنتی ژن ها مثل روش Rk39 حساسیت و ویژگی بالایی دارد که پی سی آر برای شناسایی دی ان آ حساسیت بین 80 تا 100 % دارد. این تست براساس شناسایی آنتی ژنهای پیکره ای لیشمانیا که اساس آن ایمنوکروماتوگرافی بوده صورت می گیرد (2).

با توجه به این مطلب که انگل لشمانیا می تواند برای مدتها بدون علامت در بدن انسان باقی بماند و دیگر افراد در معرض با شخص آلوده در خط آلودگی قرار گیرند و همچنین با توجه به این مساله که تا بحال مطالعه گسترده ای برای بررسی میزان شیوع این انگل در مناطق شمال شرقی ایران صورت نگرفته است، مطالعه حاضر با هدف تعیین سرو اپیدمیولوژی موارد بدون علامت لیشمانیوز احشایی، در مناطق آندمیک خراسان رضوی و شمالی در سال 93 – 94 انجام شد.

روش کار

بررسی حاضر یک مطالعه توصیفی مقطعی از نوع کاربردی بود که بر کودکان ده روستای دو استان خراسان رضوی و خراسان شمالی انجام شد. نمونه مورد نظر با روش سهمیه‌ای از میان روستا های استان خراسان براساس نقشه انتشار بیماریهای مرکز بهداشت استان های خراسان شمالی و رضوی انتخاب شدند. حجم نمونه 380 نفر برآورد شده که به دلیل افزایش توان مطالعه تعداد 442 نمونه جمع آوری شد. شیوه گردآوری اطلاعات به صورت میدانی بود و برای گرد آوری اطلاعات از چک لیست استفاده شد.

کودکان زیر 12 سال که حداقل یک سال از سکونت آن ها در منطقه های مورد مطالعه می گذشت وارد این مطالعه شدند. کودکان دارای علائم و نشانه های بالینی بارز کالاآزار مثل تب طولانی بیش از دو هفته، بزرگی طحال و ادم ژنرالیزه، کلیه افراد دارای سوء تغذیه، سابقه استفاده طولانی مدت از داروهای ایمونو ساپرسیو و یا سندرمهای نقص سیستم ایمنی که فاقد علایم بالینی بارز و یا دارای علایم غیر اختصاصی بودند از این مطالعه کنار گذاشته شدند. همچنین همه بیماران دارای سابقه بیماری کالاآزار ، افراد مبتلا به بیماری های عفونی و بیماران بستری از این مطالعه حذف گردیدند. عدم رضایت بیماران برای همکاری در این طرح نیز دیگر معیار خروج از این مطالعه بود.

افراد با همکاری بهورز هر روستا شناسایی و جهت انجام نمونه گیری به خانه بهداشت هر روستا هدایت شدند. پس از تکمیل رضایتنامه و توضیح همه مراحل مطالعه، از همه افراد شرکت کننده نمونه خون (5 سی سی خون) دریافت شد. پس از اخذ نمونه در محل، خون محیطی در تیوب های قرار داده شد و نمونه جهت جدا سازی سرم سریعا به نزدیک ترین مرکز بهداشت منتقل گردید. پس از جدا سازی سرم ها، آن ها را فریز کرده و جهت انجام تست های DAT و Rk39 به بیمارستان امام رضا(ع) مشهد منتقل گردید. چک لیست حاوی اطلاعات دموگرافیک و بالینی توسط مجریان طرح برای تمامی شرکت کنندگان بدون علامت تکمیل گردید. داده هاپس از جمع آوری وارد نرم افزار SPSS نسخه 16 گردید و سپس مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفت. از شاخص های مرکزی و پراکندگی و توزیع فراوانی برای توصیف داده ها استفاده شد.

نتایج

در کل 422 نفر از کودکان حاشیه دو استان خراسان شمالی و خراسان رضوی وارد این مطالعه شدند. از میان کل شرکت کنندگان حدود 48.5% پسر و 51.4% دختر بودند(جدول 1). در حدود 48.9% از افرادی که تست DATآن ها منفی شده بود پسر و 51.1% از آن ها دختر بودند. همچنین 40.9% از افرادی که تست DAT آن ها مثبت شده بود پسر و 59.1% آن ها دختر بودند. در کل میانگین و انحراف استاندارد سنی افراد شرکت کننده در این مطالعه 36/2±34/6 بود. همه ی افراد در دامنه سنی دو تا دوازده سال قرار داشتند. میانگین سنی دختران 268/2±44/6 و میانگین سنی پسران 439/2±25/6 بود. بررسی مقایسه ای میانگین سنی افراد به تفکیک جنسیت نشان داد که شرکت کنندگان به لحاظ سنی تفاوت معنی داری با هم نداشتند (851/1-=t) (377/0=P).

در حدود 27/13% از افراد شرکت کننده در این مطالعه در روستای مهنان و 66/10% از آن ها در روستای ینگه قلعه زندگی می کردند. همچنین، 84/11% ، 39/6% ، 61/11% ، 72/18% ، 95/9% و 16/6% از افراد به ترتیب در روستاهای نوده، اسفیدان، اخلمد، قره شاهوردی، مغان و کنگ ساکن بودند. فراوانی افراد شرکت کننده در هر کدام از روستاهای استخری و تراقی کرد 68/5% بود. نحوه توزیع سنی افراد شرکت کننده در این مطالعه به تفکیک روستای محل اقامت در جدول شماره 1 آمده است.

بررسی فراوانی افراد مورد بررسی در این مطالعه به نسبت استان محل اقامت نشان داد که 55/53 % از شرکت کنندگان در استان خراسان شمالی زندگی می کردند و 44/46% از آن ها ساکن در استان خراسان رضوی بودند(نمودار 1). میانگین سنی افراد شرکت کننده در این مطالعه در استان خراسان شمالی 08/2±33/6 و در استان خراسان رضوی 65/2±36/6 بود که تفاوت معنی داری با هم نداشتند (130/0-=t) (0005/0>P).

بررسی فراوانی جنسیت افراد مورد بررسی در این مطالعه به تفکیک استان محل اقامت نشان داد که 88/50% و 12/49% از افراد ساکن در استان خراسان شمالی به ترتیب مرد و زن بودند. همچنین 87/45 % و 12/54 % از افراد ساکن در استان خراسان رضوی به ترتیب مرد و زن بودند.

در این مطالعه دو تست DAT و RK39 به منظور بررسی احتمال ابتلا به انگل عامل لیشمانیوز احشایی روی همه شرکت کنندگان انجام شد(جدول 2). نتایج به دست آمده از تست DAT حاکی از آن بود که 400 نفر از این افراد از نظر مثبت یا منفی بودن آلودگی به انگل لیشمانیوز احشایی منفی بر آورد شدند و 22 نفر از آن ها بر اساس این معیار به انگل لیشمانیا آلوده شده بودند. به این معنی که نتایج تست DAT در94.78% از این افراد منفی و در 5.21% از آن ها مثبت بود. نتایج به دست آمده از تست Rk₃₉حاکی از آن بود که همه 422 شرکت کننده این مطالعه از نظر مثبت یا منفی بودن آلودگی به انگل لیشمانیا منفی بر آورد شدند. یعنی تست Rk39 در100% افراد وارد شده به این مطالعه منفی بود. نمودار شماره 1 فراوانی افراد آلوده به انگل لیشمانیا را در هر منطقه بر اساس تست های DAT نشان می دهد.

بر اساس نتایج به دست آمده از تست DAT، یک تفاوت معنی دار میان روستاهای مورد بررسی از نظر ابتلا یا عدم ابتلا به انگل لیشمانیوز مشاهده شد (72/66=X²) (005/0<P). همچنین، مقایسه میزان تست مثبت و منفی DAT در دو استان خراسان شمالی و رضوی نشان داد که تفاوت معنی داری میان دو استان از نظر میزان آلودگی به انگل لیشمانیا وجود دارد (38/3=X²) (005/0<P) نمودار شماره 2. میانگین سنی افرادی که بر اساس تست DAT به انگل عامل لیشمانیوز آلوده بودند 35/2±31/6 و میانگین سنی افرادی که به این انگل آلوده نبودند 505/2±91/6 بود. مقایسه میانگین سنی افرادی آلوده به انگل لیشمانیا و افراد غیر آلوده نشان داد که این افراد از لحاظ سنی تفاوت معنی داری با هم نداشتند (155/1-=t) (547/0=P). به این معنی که دامنه سنی افراد آلوده به انگل لیشمانیا با افراد فاقد آلودگی در یک محدوده بود. با توجه به اینکه تست Rk₃₉ در تمام افراد منفی بود امکان محاسبه میزان مثبت و منفی بودن تست DAT بر حسب سن نبود.

بحث

بر اساس یافته های مطالعه حاضر،نتایج تست DAT در 7/94% از شرکت کنندگان منفی و در 2/5% آن ها مثبت بود. نتایج به دست آمده از تست Rk₃₉، تمام افراد شرکت کننده این مطالعه را از نظر آلودگی به انگل لیشمانیا منفی بر آورد کرد. بر اساس نتایج به دست آمده از تست DAT، تفاوت معنی داری میان روستاهای مورد بررسی از نظر ابتلا یا عدم ابتلا به انگل لیشمانیا وجود داشت، به طوری که بیشترین میزان ابتلا به این بیماری به ترتیب در روستاهای مغان از توابع استان خراسان رضوی و استخری از توابع شیروان واقع در استان خراسان شمالی مشاهده شد. به طور کلی، میزان آلودگی به انگل لیشمانیا در روستاهای اطراف استان خراسان رضوی بیشتر از خراسان شمالی بود. وجود داشت.

تشخیص عفونت لیشمانیوز احشایی پیچیده است چرا که تظاهرات بالینی آن با سایر بیماریهای شایع مانند مالاریا، تیفوئید و سل مشابه است. از طرف دیگر این بیماری ها گاهی هم آیند هستند. علاوه براین مطلب، قابلیت انتقال این انگل به سایر افراد ضرورت شناسایی آن را در مرحله بدون علامت چند برابر می کند. مطالعات زیادی نشان داده اند که بیماری لیشمانیوز اینفاتوم در قسمتهای مختلف ایران اندمیک است (9). بر اساس یک مطالعه مروری که به بررسی خصایص بالینی لیشمانیا در مناطق اندمیک ایران پرداخت، که اکثر موارد لیشمانیوز به وسیله تست DAT، در مناطق اندمیک ایران در میان کودکان کمتر از دوازده سال تشخیص داده می شد. علایم بالینی در 75% از موارد با تست مثبت DAT مشاهده شد (10). در مطالعه حاضر موارد با علایم بالینی از مطالعه کنار گذاشته شدند و شیوع موارد بدون علامت به وسیله تست DAT ارزیابی گردید که شیوع آن 5 % ارزیابی شد.

با توجه به اینکه موارد حیوانی یکی از عوامل اصلی انتقال انگل لیشمانیا خصوصا به کودکان در کانون های اندمیک لیشمانیوز احشایی می باشند، مطالعه ای در ایران که یک منطقه آندمیک به شمار می رود به بررسی انگل لیشمانیا با استفاده از تجزیه و تحلیل مولکولی پرداخت. حضور انگل لیشمانیوز احشایی در کبد و طحال از 13.7% از جوندگان در مناطق اندمیک مشاهده شد. (11). همچنین، سگ آلوده به عنوان میزبان مخزن اصلی انتقال لیشمانیوز احشایی در منطقه مدیترانه شناخته شده است. مطالعه ای با هدف تعیین پتانسیل سگ آلوده بدون علامت در مقایسه با آنهایی که علامت دار بودند به عنوان یک منبع انتقال لیشمانیا اینفانتوم به همستر انجام شد. لیشمانیا با استفاده از آزمون DAT در 13 مورد علامت دار و 53 مورد بدون علامت شناسایی شد. نتایج بررسی میزان انتقال انگل توسط سگ ها به جوندگان حاکی از آن بود که ارتباط معنی داری میان انتشار عفونت در سگ های علامت دار و بدون علامت وجود نداشت (12). این نتایج حاکی از اهمیت ارزیابی موراد بدون علامت انگل لیشمانیوز می باشد. همچنین، مطالعه ای که در روستاهای آندمیک نپال و هندوستان صورت گرفت، میزان کالاآزار بدون علامت را ده برابر شایع تر از فرم های علامت دار آن برآورد کرد، که نشان دهنده لزوم بررسی موارد بدون علامت این انگل رانشان می دهد (4).

در مطالعه حاضرمیزان ابتلا به انگل بدون علامت لیشمانیا 5 % برآورد شد. بر اساس یک مطالعه که در یکی از روستاهای اتیوپی صورت گرفت، میزان عفونت بدون علامت لیشمانیوز 1/10 % ارزیابی شد (13). همچنین، عفونت بدون علامت لیشمانیا اینفانتوم در برزیل 9/13 % برآورد شد (14). که بسیار بیشتر از مطالعه حاضر است، به این دلیل که کالاآزار یک بیماری منطقه ای است که میزان فراوانی آن وابسته به منطقه است.

در یک بررسی آینده نگر، احتمال بروز عفونت لیشمانیوز احشایی در شمال غرب ایران 8/2 % در سال برآورد شد که کمتر از میزان به دست امده از مطالعه حاضر است. در مطالعه مذکور لیشمانیوز احشایی در یکی از هر سیزده کودک مبتلا به عفونت مشاهده شد (15). مطالعه دیگری بین سال های 1383-1386، نمونه های خون 802 نفر در مناطق شمال غربی و جنوب شرقی استان فارس را از نظر آنتی بادی های ضد لیشمانیا با روش آگلوتیناسیون مستقیم و نیز پی سی آر بررسی کرد. مطالعه مذکور حاکی از آلودگی 9/1 % از افراد ساکن در منطقه شمال غربی استان فارس بود. این میزان در منطقه جنوب شرقی استان فارس 3/1 % ارزیابی شد (16). یافته های این مطالعه نیز میزان ابتلا به لیشمانیا را کمتر از مطالعه حاضر ارزیابی کرد. بنابراین، ابتلا به عفونت بدون علامت در شمال شرقی ایران بیشتر از شمال غربی است. البته این موضوع باید از نظر تیتراسیون مورد پذیرش جهت اعلام آلودگی مثبت نیز ارزیابی گردد.

بر اساس یافته های برخی مطالعات، بیماری کالاآزار یک بیماری شایع در برخی شهر های ایران می باشد، به طوری که این بیماری در شهرهای شمالی استان خراسان رضوی خصوصا شیروان، بجنورد و مشهد، به عنوان یک بیماری اندمیک شناخته شده است (17). بر اساس مطالعه طبرستانی و همکارانش که در سال 1369 در شهر مشهد صورت گرفت، بیماری کالاآزار می تواند باعث تغییرات پارامترهای خونی در افراد گردد. بیماری کالا آزار می تواند منجر به لکوپنی ، نوتروپنی و کاهش میزان هموگلوبین گردد (18). همچنین، احتمال بروز این بیماری در افراد مبتلا به HIV که در مناطق بومی ایران زندگی می کنند، بیشتر از جمعیت عمومی است (5).

این مطالعه برای تشخیص موارد بدون علامت لیشمانیوز احشایی از دو تست Rk₃₉ و DAT استفاده شد. محبعلی و همکارانش در سال 1386 به بررسی ابتلا به انگل لیشمانیوز به وسیله تست DAT در منطقه شمال غربی ایران (مشکین شهر و اردبیل) پرداختند. همانند مطالعه حاضر، بر اساس یافته های مطالعه مذکور که بر 516 نفر صورت گرفت، حدود 50 % از افرادی که تیتر بالای1:3200 آنتی بادی را در روش DAT نشان دادند، دارای علائم بالینی بودند که از این تعداد 6/90 % اطفال زیر پنج سال و 6/4 % اطفال بالای پنج سال بودند.به طور کلی مطالعه مذکور نشان داد که DAT تستی قابل اعتماد برای تشخیص و اسکرنینگ بیماری کالاآزار است (19).

مطالعه دیگری طی یــک بررســی سرواپیدمیولوژیک در شهرستان گرمی استان اردبیل به بررسی و مقایسه روشــهای ســرولوژی DAT، IFAT و ELISA در تــشخیص لیــشمانیوز احــشایی پرداخت. بر اساس مطالعه مذکور، با استفاده از روش DAT، 8/2% از افراد دارای آنتی بادی اختصاصی ضد لیـشما نیا بـا عیـار 800 : 1 ≥ تشخیص داده شدند. همچنین 6/0 % از افراد دارای آنتی بادی اختصاصی ضد لیـشما نیا بـا عیـار 3200 : 1 ≥ از نظر سرولوژی مثبت بودند. این میزان در مطالعه حاضر بیشتر ارزیابی شد که می تواند با توجه به منطقه ای که مطالعه در آن صورت گرفته است توجیه گردد. مطالعه محبعلی نیز نشان داد که تست DAT یـک روش ساده، ارزان، بدون نیاز بـه تجهیـزات پیچیـده و قابـل اجـرا در منـاطق آنـدمیک بـرای تـشخیص لیـشمانیوز احـشایی و مطالعـات سرواپیدمیولوژی است و می تواند جایگزین مناسبی برای روشهای پرهزینة IFAT و الیزا باشد. در مطالعه حاضرنیز این تست به عنوان یک ارزیاب کارآمد با توان ارزیابی دقیق آلودگی به لیــشمانیوز احــشایی نسبت به تست Rk₃₉ ارزیابی شد(20).

بر اساس یافته های این مطالعه تست Rk₃₉ در هیچکدام از موارد آلوده به لیشمانیوز مثبت ارزیابی نشد در حالی که البرزی و همکاران اختصاصی است این تست را برای تشخیص لیشمانیوز احشایی 2/84 در صد و حساسیت آن را 100 % ارزیابی کردند (21). سایر مطالعاتی که در ایران صورت گرفتند نیز این تست را در ارزیابی موارد انسانی و حیوانی لیشمانیوز احشایی مناسب ارزیابی کرند (22, 23). اگرچه تست Rk₃₉ می تواند به عنوان یک ارزیاب مناسب در تشخیص افراد مبتلا به لیشمانیوز احشایی به کار رود با این وجود در ارزیابی موارد آلوده به این انگل کارایی لازم را ندارد.

نتیجه گیری

بر اساس یافته های مطالعه حاضر، با استفاده از تست DAT میزان ابتلا به عفونت بدون علامت لیشمانیوز در کودکان زیر نه سال بیش از 5% بر آورد شد که نشان می دهد میزان ابتلا به این انگل در منطقه شمال شرقی ایران بیشتر از سایر نقاط می باشد. همچنین میزان ابتلا به عفونت بدون علامت لیشمانیوز در استان خراسان شمالی بیشتر از خراسان رضوی می باشد. با وجود حساسیت بالای تست Rk₃₉ در تشخیص موارد آلوده به لیشمانیوز احشایی، این تست در ارزیابی عفونت بدون علامت لیشمانیوز کارایی لازم را ندارد. بنابراین استفاده از تست DAT برای تشخیص بهتر موارد بودن علامت توصیه می گردد.