مقدمه

 با توجه به شیوع بالای پوسیدگی در جامعه، توجه خاص به روش های پیشگیری ضروری است. عوامل اصلی ایجادکننده پوسیدگی شامل میکروب ها، مواد قابل تخمیر و میزبان مستعد مثل دندان ها و بزاق می باشد. میکروب ها به خصوص استرپتوکوک موتانس در شروع ایجاد پوسیدگی نقش مهمی دارد، لاکتوباسیلوس ها و قارچ ها نیز در روند پوسیدگی افزایش می یابند. کاربرد عوامل ضدمیکروبی، آنتی بیوتیک و دهانشویه های آنتی میکروبیال موجود در بازار علی رغم مفید بودن عوارضی نیز دارند.⁽¹⁾ لذا استفاده از یک داروی گیاهی که دارای اثرات ضدمیکروبی بوده و عارضه نیز نداشته باشد، ضروری به نظر می رسد. زعفران یک گیاه بومی است و به دلیل خصوصیات بیولوژیک متعدد آن در دو دهه گذشته مورد مطالعه قرار گرفته است.⁽²⁾

استرپتوکوک موتانس که نه تنها در پوسیدگی دندانی نقش دارد، بلکه درایجاد بیماری های دیگری مانند شقاق گوشه لب، التهاب غده پاروتید نیز نقش دارد.⁽³⁾

لاکتوباسیلوس ها نیز در ایجاد پوسیدگی نقش دارند و از عوامل میکروبی دیگر مثل میکروب های بیهوازی ایجادکننده بیماری لثه می باشند.⁽⁴⁾

قارچ ها نیز مانند کاندیداآلبیکنس در روند پوسیدگی و بیماری لثه نقش دارند.^(5و2)

از عوامل شیمیایی و ضدپلاک که هم در درمان و هم در پیشگیری از بیماری لثه نقش دارد می توان کلرهگزیدین را نام برد. کلرهگزیدین یکی از عوامل ضدمیکروبی است و  به اشکال مختلف از قبیل دهانشویه، خمیردندان و ژل عرضه می شود.⁽⁶⁾

اثرات ضدپلاک کلرهگزیدین به دلیل طبیعت دی کاتیونی مولکول کلرهگزیدین می باشد، که منجر به دوام اثر ضدمیکروبی در سطح دندان به صورت باکتریسیدال و باکتریواستاتیک می شود. همین ماهیت کاتیونی علت بیشتر عوارض جانبی همراه با مصرف این ماده یعنی تغییر رنگ خارجی دندان می باشد.⁽⁷⁾ عوارض جانبی متعددی برای کلرهگزیدین از قبیل از دست رفتن حس چشایی، احساس سوزش مخاط دهان، خشکی دهان گزارش شده است.⁽⁸⁾

بنابراین جستجو برای مواد ضدمیکروبی جدید که دارای حداقل عوارض جانبی باشند ضروری است. یکی از زمینه های امیدبخش برای جست و جوی اجزای فعال بیولوژیک جدید گیاهان مورد استفاده در طب سنتی از جمله زعفران می باشد.

زعفران کلاله خشک شده گیاه  Crocus stivus L. می باشد. این گیاه به صورت رسمی در لیست داروهای چینی ثبت شده است و در طب سنتی چینی برای درمان هماتوما، منوستاز، افسردگی و تشنج به عنوان یک آرامبخش استفاده می شده است.⁽⁹⁾ مطالعات اخیر ثابت کرده اند که این گیاه پتانسیل کاهش ریسک بیماری های مختلفی را دارا می باشد.⁽¹⁰⁾ خواص دارویی متعددی برای زعفران ذکر شده است. برخی متابولیت های مشتق شده از کلاله زعفران به دلیل عملکرد هیپولیپیدمیک، ضدسرفه، آنتی اکسیدان، آنتی دیابت و ... آثار درمانی بسیاری از خود نشان داده اند. عصاره های آبی و الکلی زعفران، محافظت کننده قلب و مقابله کننده با اختلالات نورودژنراتیو هستند. خصوصیات دارویی متعدد زعفران مربوط به اجزای مختلف آن مانند Crocetin، Crocin و سایر موادی است که دارای خاصیت قوی آنتی اکسیدان و جمع آوری رادیکال های آزاد اکسیژن و سیتوکاین های پیش التهابی می باشند.⁽⁸⁾

مطالعات نشان داده  ند که بیش از 150 ماده مختلف در کلاله زعفران وجود دارد. قویترین اجزای زعفران کاروتنوئیدها و آلدهیدهای مونوترپن هستند. مطالعه بر روی ارتباط عملکرد و ساختار مولکول نشان داده است که برخی ویژگی های زعفران به دلیل مشتقات دگلیکوزیله آن می باشد، و بقیه با مشتقات گلیکوزیله مرتبط می باشد.⁽¹⁾

اثرات ضدمیکروبی زعفران نیز در مطالعات متعددی مورد بررسی قرار گرفته است.⁽¹⁾ Sengul و همکارانش⁽¹¹⁾ طی بررسی های خود عنوان می کنند که زعفران می تواند منبع غنی از عوامل آنتی اکسیدان و آنتی میکروبیال باشد.

هدف از این مطالعه بررسی اثر ضدمیکروبی عصاره آبی و الکلی زعفران بر میکروب های بیماری زا حفره دهان از قبیل استرپتوکوکوس موتانس، لاکتوباسیل و کاندیداآلبیکانس بود.

مواد و روش  ها

در تحقیقات میکروبی حداقل 6 سویه از هر میکروب کافی است. از طرفی به دلیل هزینه بر بودن، امکان اضافه کردن تعداد نمونه ها وجود ندارد، لذا جهت بررسی اثر عصاره آبی و الکلی زعفران، بر روی میکروب های بیماری زای دهان، تعداد 6 دانش آموز 9 ساله که هیچگونه بیماری سیستمیک نداشته از یک دبستان به طور تصادفی انتخاب گردیدند. نمونه ها از پلاک میکروبی، بزاق و پوسیدگی ناحیه دندان های مولر برداشته شد و جهت بررسی به آزمایشگاه برده شد. در هر بیمار سه میکروب استرپتوکوکوس موتانس، کاندیداآلبیکنس و لاکتوباسیل بررسی گردید، که در مجموع 18 میکروب بررسی شد.

به جای کاربرد نمونه های استاندارد، از روش نمونه گیری استفاده شد. جهت نمونه گیری از پلاک دندانی، به کمک سوند استریل از روی سمت باکال و لینگوال دندان های ناحیه خلفی پلاک برداشته شد و روی سواپ استریل قرار داده شد و سپس داخل لوله آزمایش حاوی ماده ترانسپورت قرار داده شد. جهت نمونه گیری از بزاق، سواپ آغشته به بزاق بیمار شد و روی پلیت حاوی محیط کشت مایع ترانسپورت به آرامی کشیده شد و به آزمایشگاه برده شد. سپس جهت نمونه گیری از پوسیدگی، با سوند پوسیدگی های سطحی کنار زده شد و از عمق پوسیدگی نمونه گیری انجام شد و جهت جداسازی باکتری به آزمایشگاه برده شد.

نمونه ها در محیط مایع ترانسپورت Modified Medium Stuart که دارای 10-5 گرم پپتون در لیتر بوده و سیستم بافری داشت، (باکتری ها تکثیر نیافته و از بین نمی روند) نگهداری شد و حداکثر ظرف یک ساعت به آزمایشگاه رسانده می شد.

برای جداسازی Lactobacillus spp. قسمتی از نمونه در محیط کشت مایع MRS Broth کشت گردید و به مدت 48 ساعت در 37 درجه سانتیگراد و شرایط بی هوازی نگهداری گردید. سپس از باکتری های رشد کرده در محیط MRS Broth برداشته و در محیط MRS Agar  کشت داده شد. کلنی هایی که ویژگی های مورد نظر را داشت به عنوان لاکتوباسیلوس در نظر گرفته شد.

جهت جداسازی استرپتوکوک موتانس، نمونه ها در محیط استرپتوکوک سلکتیو آگار کشت و در حرارت  37 درجه سانتیگراد به مدت 24 ساعت در شرایط میکروآیروفیل گرمخانه گذاری گردید.

برای جداسازی کاندیدا، نمونه ها در محیط کشت سابورو دکستروز آگار و محیط کشت رنگی کروم آگار کشت داده شد و حضور کاندیداآلبیکنز با آزمون بررسی میکروسکوپی و تولید ژرم تیوب بررسی شد.

تهیه سوسپانسیون میکروبی، پس از جداسازی میکروب ها، از همه آن ها یک کشت اولیه تهیه شد و در یخچال به عنوان منبعی برای انجام سایر آزمایشات نگهداری شد. برای انجام هر آزمایش باید میکروب جدید و تازه داشت تا مطمئن باشیم میکروب ها زنده اند.

روز قبل از آزمایش از همه نمونه های میکروبی کشت ایزوله روی محیط بلاد آگار برای استرپتوکوک موتانس و لاکتوباسیل، و آگار Soyabean casein) trypton soya agar) digest agar) متعلق به شرکت (Himedia) برای کاندیدا کشت داده می شد و در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد قرار داده شد. در مورد لاکتوباسیل با توجه به اینکه میکروبی بی هوازی است، برای رشد، نیازمند محیط خاص باکتری های بی هوازی است. برای کشت بی هوازی باید میکروب ها داخل جار بی هوازی) ظرفی غیر قابل نفوذ که هیچ گونه تبادل گازی با محیط خارج ندارد و برای کشت باکتری های بی هوازی مورد استفاده قرار می گیرد (قرار داده شوند، برای ایجاد این شرایط داخل جار یک عدد گاز پک (MERCK) گذاشت، که یک کیت شیمیایی جاذب اکسیژن است، با مقدار 6 میلی لیتر نرمال سالین خیس شد و در انکوباتور  37 سانتیگراد قرار داده شد.

پس از رشد میکروب ها در این محیط های یک روزه از این میکروب ها سوسپانسیون تهیه شد. به این صورت که به کمک پیپت استریل، مقدار کمی نرمال سالین استریل روی پلیت حاوی میکروب ریخته شد و کمی با کلنی ها مخلوط گردید، سپس به یک لوله آزمایش استریل که حاوی 9 میلی لیتر نرمال سالین بود از این سوسپانسیون میکروبی اضافه شد تا غلظتی معادل استاندارد نیم مک فارلند حاصل شود.

این سوسپانسیون حاوی (Colony forming unit per milliliter)، CFU/ml 10⁸ میکروب بود. سپس روی ویبراتور سوسپانسیون همگن شد.

1 سی سی از این سوسپانسیون به وسیله پیپت استریل به 9 سی سی نرمال سالین دیگر اضافه  شد و سوسپانسون میکروب  CFU/ml10⁷ تهیه شد و به همین ترتیب سوسپانسیون CFU/ml 10⁶ از سوسپانسیون CFU/ml 10⁷ تهیه شد.

برای تهیه عصاره الکلی به ازای هر 10 میلی گرم پودر زعفران، µ100 الکل 80 درجه در یک ارلن مایر ریخته شد. مدت 72 ساعت ارلن روی شیکر با سرعت 100 دور در دقیقه قرار داده شد. در پایان 72، ساعت ابتدا محتویات ارلن از چند لایه پارچه تنظیف و سپس از کاغذ صافی عبور داده شد. عصاره حاصله پس از تغلیظ با دستگاه حذف حلال، در دمای 40 درجه سانتیگراد داخل چند پلیت ریخته شد و سپس روی بن ماری 40 درجه کاملاً خشک گردید. مقدار عصاره الکلی لازم برای رسیدن به غلظت مورد نظر روی ترازو اندازه گیری شد و در حجم مورد نظر از محیط کشت داخل لوله آزمایش حل شد. لوله آزمایش حاوی محلول عصاره الکلی روی ویبراتور ویبره شد تا به یک محلول شفاف و یکدست رسانده شود. پس از تهیه محلول با غلظت اولیه مورد نظر، سایر غلظت ها با نسبت 2/1، 2/1 داخل ویال های استریل در مجاورت شعله تهیه شد. به این صورت که 2/1 از غلظت اولیه برداشته می شد و به همین مقدار محیط کشت اضافه شد و غلظتی نصف غلظت اولیه به دست آمد و به همین صورت تا غلظت های پایین تر این کار ادامه پیدا کرد و از غلظت آخر 2/1 برداشته شد و دور ریخته شد.

برای تهیه عصاره آبی به ازای هر 10 میلی گرم پودر زعفران، 100 میلی لیتر آب مقطر استفاده شد و حل گردید. سپس برای 24 ساعت بر روی شیکر انکوباتور قرار گرفت و مواد از چند لایه پارچه تنظیف رد شدند. سپس عصاره ها در بالن ته گرد ریخته شدند و در فریزر منفی 80 درجه قرار گرفتند. پس از یخ زدن، عصاره ها در دستگاه فریز درای قرار داده شدند. (در خلا حذف حلال صورت گرفت (پس از تهیه غلظت اولیه مثل عصاره الکلی رقیق سازی سریالی با نسبت 2/1، 2/1 داخل ویال های استریل انجام شد و از غلظت انتهایی، 2/1 دور ریخته شد.

جهت مقایسه تأثیر عصاره آبی و الکلی زعفران بر روی میکروب های مورد آزمایش، از آنتی بیوتیک ضدباکتری استاندارد یعنی پنی سیلین (شرکت لقمان) و یک ضد قارچ مؤثر بر کاندیداآلبیکنس یعنی نیستاتین( شرکت جابربن حنان – تهران - ایران( استفاده شد. برای بررسی اثر آنتی بیوتیک بر این سه میکروب، غلظت هایی از پنی سیلین و نیستاتین به همان روش رقیق سازی سریالی و در محیط کشت های مناسب میکروب مورد نظر تهیه شد. پودر این داروها روی ترازو اندازه گیری شد و در محیط کشت داخل لوله آزمایش به کمک ویبراتور حل شد و با نسبت با نسبت 2/1، 2/1  سایر غلظت ها نیز تهیه شد.

روش آزمایش به صورت رقیق سازی متوالی(Serial Dilution) درون پلیت  96  خانه بود. عصاره آبی و الکلی باید داخل محیط کشت مایع حل شده و غلظت های مختلف از آن ها تهیه شود که این محیط کشت برای میکروب های مختلف متفاوت است.محیط کشت برای استرپتوکوک موتانس B.H.I.B (Brain Heart Infusion Broth)، کاندیداM.H.B (Muller Hinton Broth)  و لاکتوباسیل (Brain Heart Infusion) B.H.I می باشد. همه محیط کشت ها متعلق به شرکت Himedia هندوستان بودند.

جهت انجام آزمایش از پلیت 96 خانه استفاده شد. مقدار μl 200 از هر غلظت از ماده مورد آزمایش (عصاره آبی یا الکلی) و همین طور  μl200 از غلظت های مختلف پنی سیلین و یا نیستاتین جهت مقایسه اثر آنها با تأثیر عصاره آبی و الکلی داخل چاهک ها ریخته شد. و در چاهک های کنترل مثبت و منفی نیز همین مقدار از محیط کشت ریخته شد. سپس به همه چاهک ها به جز چاهک کنترل منفی مقدارμl  20 از سوسپانسیون میکروبی اضافه شد. هر آزمایش برای هر میکروب سه بار تکرار شد. برای میکروب بی هوازی لاکتوباسیل پلیت ها داخل جار بی هوازی حاوی گازپک قرار داده شد. پس از ریختن مقدار لازم از هر غلظت پلیت ها به مدت یک شب داخل انکوباتور 37 درجه سانتیگراد قرار داده شدند. در این مدت از رسیدن رطوبت به میکروب ها جلوگیری شد.

برای بررسی نتایج و اینکه مشخص شود در کدام چاهک ها میکروب رشد کرده است، مقدار کدورت چاهک ها تعیین شد. به دلیل رنگی بودن مواد مورد آزمایش، تشخیص کدورت ناشی از رشد میکروب با چشم مشکل بود لذا، از غلظت های مشکوک، کشت ایزوله تهیه شد. به این صورت که در مجاورت شعله یک لوپ که روی شعله حرارت دید وارد چاهک های مورد نظر شد و روی محیط کشت آگار کشیده شد. آن گاه این محیط کشت ها، 24 ساعت داخل انکوباتور قرار داده شدند، روز بعد هر پلیتی که در آن رشد میکروب نداشت، یعنی کلنی هیچ باکتری در آن دیده نمی شد، غلظت MBC محاسبه می شد. تمامی مراحل بررسی و ثبت نتایج توسط نویسنده انجام شد.

MIC (Minimal Inhibitory Concentration)، کمترین میزان غلظت یک عامل ضدمیکروبی که از رشد میکروارگانیسم جلوگیری می کند، به عنوانMIC  شناخته می شود. تست MIC ممکن است روی آگار و یا یک مایع واسط انجام شود. روش معمول تعیین MIC، تکنیک رقیق سازی متوالی است.⁽¹¹⁾

MBC (Minimal Bactericidal Concentration)، کمترین غلظت عامل ضد میکروبی که اکثر (9/99 درصد) جمعیت میکروبی تلقیح شده را از بین می برد، و در این آزمایش غلظت اولین چاهکی که در کشت ایزوله آن هیچ میکروبی رشد نیافت غلظت MBC تعیین می شد.

داده ها به صورت میانگین و انحراف معیار گزارش گردید. در این تحقیق برای مقایسه سه گروه از آزمون آنالیز واریانس یک طرفه و برای مقایسه دوبه دوی گروه ها از آزمون توکی استفاده گردید. سطح معنی داری در آزمون ها 05/0 در نظر گرفته شد.

یافته ها

در این مطالعه اثر ضدمیکروبی عصاره آبی و الکلی زعفران، بر روی سه میکروب بیماری زای دهان (استرپتوکوک موتانس، لاکتوباسیلوس و کاندیداآلبیکنس) مورد بررسی قرار گرفت. میانگین MBC به دست آمده برای عصاره الکلی و آبی زعفران، پنی سیلین و نیستاتین بر حسب mg/ml در 6 نمونه استرپتوکوک موتانس و لاکتوباسیل و هشت نمونه کاندیداآلبیکنس در جداول 1 تا 3 آمده است.

آنالیز واریانس یک طرفه نشان داد میانگین غلظت MBC روی استرپتوکوک موتانس سه گروه تفاوت معنی داری دارند (جدول 1) آزمون توکی برای مقایسه دوبه دوی گروه ها حاکی از تفاوت بین هر سه گروه با یکدیگر بود (001/0P<).

آنالیز واریانس یک طرفه نشان داد سه گروه از نظر میانگین MBC روی لاکتوباسیل تفاوت معنی داری دارند (جدول 2) آزمون توکی برای مقایسه دوبه دوی گروه ها حاکی از تفاوت بین عصاره آبی با پنی سیلین و همچنین عضاره الکلی با پنی سیلین بود. (001/0P<) ولی عصاره آبی با الکلی تفاوت معنی داری با هم نداشت (58/0P=).

آنالیز واریانس یک طرفه نشان داد میانگین MBC روی کاندیداآلبیکانس در سه گروه تفاوت معنی داری دارند (جدول 3). آزمون توکی برای مقایسه دوبه دوی گروه ها حاکی از تفاوت بین عصاره آبی با نیستاتین (007/0P=) بود و همچنین عضاره الکلی با نیستاتین و عصاره آبی با الکلی نیز تفاوت معنی داری داشت (001/0P<).

جدول 1 : میانگین و انحراف معیار غلظت (MBC mg/m) عصاره ی آبی و الکلی زعفران و پنی سیلین روی استرپتوکوک موتانس

جدول 2 : میانگین و انحراف معیار غلظت (MBC mg/m) عصاره آبی و الکلی زعفران و پنی سیلین روی لاکتوباسیل

جدول 3 : میانگین و انحراف معیار غلظت (MBC mg/m) عصاره آبی و الکلی زعفران و نیستاتین روی کاندیداآلبیکنس