شناسایی مولکولی نوموسیستیس جیرویسی در بین بیماران دیابتی مبتلا به اختلال تنفسی در بیمارستان امام رضا (ع) مشهد 93-1392

مقدمه

نوموسیستیس جیروویسی عامل بیماری نوموسیستوزیس1 است که قبلا بطور اختصار PCP  گفته می شد یکی از عوامل قارچی ذات الریه بینابینی سلولی2 می باشد. همراه  باشیوع و گسترش بیماری  ایدز در جهان موارد ابتلا به بیماری نوموسیستوزیس بیشتر شد. این بیماری که قبلا فقط در یتیم خانه هاو اماکن دور از نور خورشید و هوای سالم مشاهده می شد به یک عفونت شایع در بین مبتلا به ایدز تبدیل شد(1-6). علاوه بر مبتلایان به ایدز گروه های دیگری که احتمال بیشتری برای ابتلا به بیماری نوموسیستوزیس دارند عبارتند از:  افراد مبتلا به اختلالات ایمنی و دارای بیماری های زمینه ای بجز ایدز، مبتلایان به انواع بدخیمی، دیابت، مبتلایان  به نقص های ایمنی مادرزادی، گیرندگان عضو پیوندی و استفاده کنندگان از داروهای سرکوب کننده ایمنی(7-11). در ایران چند مطالعه بر مبتلایان به ایدز و سایر بیماری های زمینه ای و نقص ایمنی انجام شده است که نتایج این مطالعات نشان می دهد بیماری در میان افراد سالم نیز دیده می شود. افراد مبتلا به دیابت کنترل نشده با مشکلات زیادی روبرو هستند از جمله استعداد ابتلا به عفونت های میکربی و قارچی (12، 13).

هدف از این مطالعه که در بخش ریه و آزمایشگاه قارچ شناسی بیمارستان امام رضا، مشهدانجام شد بررسی از نظر آلودگی به قارچ  Pneumocystis Jirovecii در بین بیماران ریوی با زمینه دیابت بود.

روش کار

در این مطالعه مقطعی که طی مدت یک سال (بهمن 1391 تا بهمن1392) در بخش برونوسکوپی مرکز آموزشی، پژوهشی و  درمانی امام رضا (ع) انجام گردید،   نمونه مایع شستشوی برونش (BAL)3 کل 16 بیمار دیابتی دارای اختلال مزمن تنفسی توسط متخصصین بیماریهای ریه نمونه گیری شده و به بخش انگل شناسی و قارچ شناسی ارجاع داده شد. تجزیه و تحلیل آماری نتایج با استفاده از نرم افزار SPSS  و استفاده از آزمون های آماری ضریب دقیق فیشر و تی انجام شد.

این نمونه ها بر اساس در خواست پزشک معالج و در ادامه روند استاندارد  تشخیص و درمان بیماران بوده و هیچ روش تشخیصی و نمونه گیری  اضافه ای به بیمار تحمیل نشد،  با این وجود هنگام دریافت شرح حال و تکمیل   پرسشنامه، رضایت اگاهانه بیماران دریافت  شد. پس از تکمیل اطلاعات، نمونه ها با دور 4000 سانتریفیوژ شده و مایع رویی از رسوب انتهایی جدا شد. در این مرحله رسوب در یک میکروتیوپ استریل ریخته و تا زمان انجام آزمایش PCR در 4 درجه سانتیگراد نگهداری شد. جهت استخراج DNA نمونه ای جمع آوری شده از کیت تجاری Primeprep^TM Genet Bio (ساخت کره جنوبی) استفاده شد که بر اساس  دستورالعمل کیت مذکور DNA نمونه ها استخراج شدند. برای انجام روش مولکولی از پرایمرهای الیگونوکلئوتیدی اختصاصی برای نوموسیستیس جیرویسی استفاده شده که هردو مربوط به زیر واحد میتوکندریایی بزرگ RNA ریبوزومی mtLSU rRNA شامل پرایمرهای خارجی pAZ102-Hو pAZ102-E پرایمرهای داخلی  pAZ102-Xو pAZ102-Y استفاده شد. پرایمرهای pAZ102-E و pAZ102-H قطعات 346 جفت بازی و پرایمرهای  pAZ102-Xو pAZ102-Y قطعات 260 جفت بازی را تکثیر می کنند (14).

برای انجام آزمایش PCR در مرحله اول: دو میکرولیتر از DNA استخراج شده به محلول محتوی: 5/2 میکرولیتر بافر 10X، 5/2 میکرولیتر از MgCl2، 5/0 میکرولیتر از dNTPs، 1 میکرولیتر از پرایمرها، و 1 میکرولیتر از Taq polymerase اضافه شد. برنامه انجام PCR به صورت زیر با دستگاه ترموسایکلر ABI (ساخت امریکا) انجام گردید:

مرحله اول برای تهیه قطعه ژنی 346 بازی، ابتدا نمونه های اماده شده  5 دقیقه در ^c°94 نگهداری شدند                             (Initial Denaturation).  سپس 15 سیکل متوالی شامل: 1 دقیقه در 94 درجه سانتیگراد (Denaturation)، 1 دقیقه در 56 درجه سانتیگراد (Annealing) و 1 دقیقه در 72 درجه سانتیگراد (Extension)

برای راند داخلی PCR (Nested PCR) و تهیه قطعه ژنی 260 بازی، ترموسایکلر همانند مرحله اول، برنامه ریزی شد با این تفاوت که دمای Annealing در این مرحله 59 درجه سانتیگراد درنظر گرفته شد.

محصول واکنش PCR داخلی در ژل آگاروز محتوی رنگ سایبرگرین با استفاده از دستگاه الکتروفورز RUN شد و نتیجه با استفاده از دستگاه لومیناتور مورد تصویر برداری قرار گرفت (15).

اندازه گیری قند خون تمام بیماران در زمان گرفتن نمونه  BAL  به روش رنگ سنجی (GOD-PAP) انجام شد (16).

نتایج

در طول  این مطالعه بیش از 70 بیمار مبتلا به اختلالات تنفسی و دارای بیماری های زمینه ای کاهنده ایمنی که اندیکاسیون انجام برونکوسکوپی را داشتند در بخش های اورژانس داخلی و ریه مرکز آموزشی پژوهشی درمانی امام رضا (ع) بررسی شدند. . برای هر فرد وارد شده به مطالعه  پرسشنامه ای شامل اطلاعات شخصی و بالینی  سوابق بیماری های زمینه ای و نتایج ازمایشگاهی در پرسشنامه ثبت می شد. از این میان شانزده بیمار دیابتی مبتلا به اختلال تنفسی معیار های ورود به این مطالعه را دارا بودند . تعداد 16 نمونه مایع شستشوی برونش (BAL) که توسط متخصصین بیماریهای ریه تحت شرایط استاندارد گرفته شده و به آزمایشگاه قارچ شناسی بیمارستان امام رضا ارسال شده بود، مورد آزمایش مستقیم و مولکولی قرار گرفت. پس از طی مراحل آزمایشات و جمع آوری اطلاعات پرسشنامه و تجزیه و تحلیل آماری نتایج به شرح زیر حاصل شد:

از شانزده بیمار وارد شده به مطالعه 9  نفر مرد (3/56 %) و 7 نفر زن (8/43%) بودند. علائم بالینی این بیماران در جدول شماره 1 به تفکیک جنس مشخص گردیده است.

بحث

اولین موارد بیماری نوموسیستوزیس (PCP)  در اواخر جنگ جهانی دوم از یک یتیم خانه در اروپا گزارش شده است (3). بیشترین موارد بیماری در میان افراد مبتلا به ایدز دیده شدو بررسی گردیده است اما گروه دیگری از جامعه که احتمال بیشتری برای ابتلا به بیماری نوموسیستوزیس دارند مبتلایان به اختلالات ایمنی بجز ایدز می باشند (3، 17).

هر چند دیابت را نمی توان به عنوان یک بیماری نقص ایمنی به حساب آورد، لیکن اختلالاتی که در بیماران دیابتی ایجاد می شود می تواند سطح ایمنی را به شکل محسوسی کاهش دهد. اینکه بیماران دیابتی بیشتر دچار عفونت های باکتریال و ویرال می شوند دلیل روشنی بر این مطلب است.  دلایل علمی که بتواند این موضوع را تایید نماید قابل توجه اند . یکی از اختلالاتی که در رابطه با کاهش سطح ایمنی در این گونه بیماران اتفاق می فتد کم شدن فعالیت سلول های مسئول در دفاع از بدن می باشد.  عملیات سلول های دفاعی شامل  سلول های پلی مورفونوکلوئر و مونوسیت ها و ماکرو فاژ ها نظیر تهاجم1، بیگانه  خواری2، کشتن توسط سلول های کشنده3 به طور بارزی کاهش می یابد. این موارد پس از کنترل صحیح بیماری دیابت برگشت پذیر است (13).

بالا بودن قند خون منجر به کاهش قدرت سیستم ایمنی، افزایش چسبندگی سطحی سلول ها و همینطور اختلال در سیستم ایمنی هومورال و البته سرکوب گیرنده های سطحی سلولهای سیستم ایمنی می شود.با توجه به گزارشات اپیدمیولوژیک شیوع دیابت در جوامع معادل 10 % است که آماری بسیار بیشتر از آمار ایدز در جامعه است بنابراین اختلال تنفسی در این بیماران مهم و قابل بررسی است. بیماری دیابت زمینه ساز ابتلاء به انواع متعددی  از عفونت های قارچی است که از آن جمله موکور مایکوزیس و کاندیدیازیس را می توان نام برد . در یک مطالعه 75% از بیماران دیابت داشته اند(18).در مطالعه دیگر تمام بیماران مبتلا به کراتیت قارچی کاندیدائی مبتلا به دیابت بوده اند(19). حتی دیابتی هائی که دچار زخم پای دیابتیک می شوند، ممکن است زخم هایشان ناشی از عفونت قارچی باشد یا اینکه قارچ ها بر زخم پای دیابتی سوار شوند(20). با این حال گزارش های اندکی از ابتلاء به نوموسیستوزیس در زمینه بیماری دیابت در دست است. در مطالعه سانو4 در سال 2007 گزارشی از یک مورد ابتلا به نوموسیستیس جیرویسی  در یک بیمار 76 ساله مبتلا به دیابت تیپ 2 گزارش شده که پس از درمان با تریمتوپریم/ سولفومتوکسازول درمان شده است (16). در مطالعه اخیر در میان 16 بیمار دیابتی دارای اختلال تنفسی فقط سه نفر (8/18 %) از نظر ابتلا به نوموسیستوزیس با آزمایش مولکولی مثبت شناخته شدند که نمی توان نتیجه گیری قاطعی در این مورد ارائه نمود. با این حال درصد آلودگی به قارچ مذکور به نسبت جمعیت مطالعه شده و نیز مطالعاتی که در سایر جمعیت ها انجام شده است چشمگیر است.

هرچند تمام بیماران در این مطالعه مورد معاینه برونکوسکوپی قرار گرفته و مایع حاصل از شست و شوی برنش(BAL)  آن ها به روش مستقیم و  ملکولی آزمایش شده است، لیکن در مطالعات دیگر از خلط و حتی آب دهان بیماران توانسته اند نوموسیستیس را جدا نمایند.

از نگاه دیگر باید توجه داشت در عین حال که دستگاه برونکوسکوپ پس از هر بار استفاده شستشو و ضد عفونی می شود شواهدی در دست است که احتمالا مواد ضد عفونی کننده فقط روی باکتری ها و ویروس ها تاثیر دارندو ممکن است همیشه روی قارچ ها تاثیر نداشته باشند و همین مورد می تواند زنگ خطری باشد برای انتقال آلودگی از طریق دستگاه برونکوسکوپ.

 شیوع نوموسیستوزیس در بین گروههای مختلف در ایران بین 7/11 تا 7/12 بر حسب مطالعات مختلف متغییر بوده است که به نظر می رسد نوع جمعیت انتخابی و شرایط اقلیمی منطقه  و سایر عواملی که متاسفانه دقیقا مورد کنکاش قرار نگرفته اند در آن مطالعات موثر بوده است (21-24).

بیماران بخصوص افراد سالخوردهِ و دارای نقص ایمنی و مبتلا به نوموسیستیس جیرویسی  ممکن است به علت بیماری های دیگر، در بخش های ویژه بیمارستانی حضور پیدا کنند، در نتیجه این افراد می توانند عامل انتقال عفونت نوموسیستیس جیرویسی  به دیگر افراد دچار اختلال سیستیم ایمنی شوند.

در ایران همانند بسیاری از کشور های در حال توسعه به دلیل کمبود منابع در بیمارستان ها و بخش های دولتی از روش های قدیمی تر برای تشخیص عوامل عفونی استفاده می شود از جمله در تشخیص نوموسیستوزیس که از رنگ آمیزی گیمسا برای تشخیص استفاده می شود که تماما به توان علمی و عملی تکنسین آزمایشگاه وابسته است و از حساسیت پایینی برخوردار است. حال آنکه استفاده از روش مولکولی واکنش زنجیره ای پلیمراز به دلیل حساسیت و اختصاصیت بالا در تشخیص نوموسیستیس جیرویسی  در اکثر مقالات مورد ارزیابی قرار گرفته است (22،  25-27).

نتیجه گیری

بر اساس نتایج آزمایشات مولکولی در میان جمعیت مورد بررسی بیماری نوموسیستوزیس در منطقه ما وجود دارد و عدم وجود گزارشات پیش از طرح به علت استفاده از روش های روتین و با حساسیت کم بوده است. پس استفاده از روش مولکولی شرایط را برای تشخیص موارد بیشتری از بیماران هموار می سازد. دیگر اینکه بیماری نوموسیستوزیس در بیماران دارای نقص یا اختلال ایمنی نیز بروز می کند. بنابراین باید این بیماران نیز در زمان ابتلا به اختلال تنفسی از نظر نوموسیستوزیس بررسی شوند.

بررسی از نظر نوموسیستوزیس بر مبتلایان به نقص های ایمنی به صورت روتین مطمئنا منجر به کشف بیشتر موارد بیماری و البته تشخیص و درمان سریعتر این بیماران خواهد شد. با توجه به عدم گزارش مورد مثبت نوموسیستیس    پیش از اجرای این طرح در مشهد، نتایج این مطالعه می تواند پایه ای برای تحقیقات بعدی در این زمینه باشد.