مقدمه

کاندیدیازیس یک بیماری مهم و شایع قارچی مخاط دهان است که توسط گونه‌های مختلف کاندیدا  ایجاد می‌شود. برفک یا تراش (Thrush) شایع‌ترین شکل کاندیدیازیس است که با افزایش رشد و تکثیر گونه‌های مختلف کاندیدا  نظیر کاندیدا‏آلبیکنس در دهان آغاز می‌شود. کاندیدا‏آلبیکنس به اشکال مختلفی همچون مخمری، هایف کاذب و هایف حقیقی وجود دارند و قادرند در دامنه‌ی pH بین 2 تا 8 و در شرایط بی‌هوازی، کم‏هوازی و حتی هوازی تکثیر یابند. گونه‌های کاندیدا قسمتی از فلور طبیعی دهان (50-25 درصد) افراد سالم را تشکیل می‌دهند. در بیماران بستری، فراوانی گونه‌های کاندیدا در دهان بیشتر از این مقدار می‌باشد. این میزان حتی در حالت‌های خاص نظیر بیماران مبتلا به ایدز، استفاده از دندان‌های مصنوعی، بیماران مبتلا به دیابت، شیمی درمانی، بدخیمی‌ها و کودکان بیشتر نیز می‌باشد.⁽¹⁾ در مطالعه‌ای در سال 1382 بر روی 318 بیمار، میزان شیوع کاندیدیازیس دهانی حدود 4/21 درصد گزارش شد.⁽²⁾ یک تحقیق در سال 1389 بر روی افراد مبتلا به ایدز انجام گرفت و میزان شیوع کاندیدیازیس دهانی 59 درصد اعلام شد.⁽³⁾ در یک مطالعه‌ی دیگر، میزان شیوع کاندیدیازیس دهانی در بیمارن مبتلا به دیابت 3/58 درصد گزارش شد.⁽⁴⁾ به طور کلی، حدود 90 تا 100 درصد از عفونت‌های مخاطی و 50 تا 70 درصد از عفونت‌های خونی ناشی از کاندیدا‏آلبیکنس است.⁽⁵⁾

 افزایش مقاومت کاندیدا‏آلبیکنس به داروهای ضدقارچی استاندارد سبب گردید تا به گیاهان دارویی به عنوان ترکیبات طبیعی توجه خاصی شود. چای سبز (Camellia sinensis) یک نوشیدنی قدیمی با قدمت 5000 ساله است. چای سبز حاوی ترکیبات پلی‌فنول بالا با خواص آنتی‌اکسیدانی، ضدباکتریایی و ضدسرطانی می‌باشد. همچنین چای سبز مانع از پوسیدگی دندان می‌گردد.^(8-6) گیاه بادَرَنجبویه یا بادَرَنگْبویه یا وارَنگ‌بو (Melissa officinalis)گیاهی است از تیره نعنائیان (Lamiaceae)که دارای یک ماده‌ی تلخ، تانن، کامفر، قندهای مختلف، مواد رزینی، مواد پکتیکی و 1/0 تا 25/0 درصد (گاهی تا 75/0 درصد) اسانس است که ماده‌ی مؤثره‌ی آن به حساب می‌آید.⁽⁹⁾ زیره‌ی سبز  (Cuminum cyminum) گیاهی است از خانواده‌ی جعفری که قسمت مورد استفاده‌ی این گیاه میوه‌ی آن است. زیره‌ی سبز دارای صفاتی شبیه زیره‌ی سیاه و انیس است. میوه‌ی این گیاه دارای تانن، 7 درصد روغن، 13 درصد رزین، آلورون و اسانسی معادل 5/2 تا 4 درصد می‌باشد.⁽⁹⁾ چای سبز و بادرنجبویه گیاهانی هستند که از پوسیدگی دندان جلوگیری می‌کنند و جهت خوشبو کردن و ضدعفونی نمودن دهان به کار می‌روند. از طرفی در متون طب جدید از اثرات ضدباکتریایی و ضدقارچی این گیاهان سخن به میان آمده است. لذا در تحقیق حاضر استفاده از این گیاهان همراه با زیره‌ی سبز به عنوان یک ترکیب پیشنهادی برای ساخت دهانشویه‌ی مرکب مورد بررسی آزمایشگاهی قرار گرفت.^(12-9)

مواد و روش‌ها

روش تهیه‌ی اسانس روغنی زیره‌ی سبز به روش تقطیر با آب (Hydrodistillation): مقدار 100 گرم از دانه‌های خشک زیره‌ی سبز با استفاده از آسیاب برقی خرد شدند. دانه‌های پودر شده به داخل بالن ژوژه دستگاه اسانس‌گیری (کلونجر مدل دارونامه بریتانیا) ریخته شدند و به آن 700 میلی‌لیتر آب مقطر اضافه گردید. جریان آب سرد مبرد برقرار گشته و بالن ژوژه درون هیتر برقی دستگاه جا گرفت و دستگاه روشن شد. بعد از جوش آمدن، درجه حرارت هیتر برقی به گونه‌ای تنظیم شد که جوشیدن شدید موجب انتقال آب و تفاله گیاه به داخل لوله دستگاه اسانس‌گیری نشود و دهانه‌ی بالن ژوژه مسدود نگردد تا مانع از جریان آسان بخار آب به داخل مبرد دستگاه نشود. مقدار کمی آب مقطر به داخل بورت جمع کننده‌ی عرق و اسانس ریخته شد، به طوریکه اسانس فقط در ستون عمودی و در قسمت بالای انشعاب V شکل جمع گردید. اجازه داده شد که مدت دو ساعت جریان تقطیر انجام شود. بعد از دو ساعت، هیتر دستگاه خاموش و حجم اسانس جمع شده با کمک درجات روی بورت دستگاه، مشخص و یادداشت شد. سپس به ملایمت شیر خروجی بورت باز شد. ابتدا عرق گیاه در یک شیشه رنگی جمع‌آوری و بعد از آن اسانس گیاه در شیشه رنگی جداگانه جمع آوری گردید. درپوش شیشه محتوی اسانس با استفاده از پارافین مسدود و تا زمان استفاده داخل یخچال قرار داده شد.⁽¹³⁾

روش تهیه‌ی عصاره‌ها‌ی آبی چای سبز و بادرنجبویه: میزان لازم از گیاهان (100 گرم) آسیاب شدند و به آن 400 میلی‌لیتر آب مقطر اضافه گردید. نمونه‌ها روی حرارت ملایم قرار داده شدند و دائماً محلول مخلوط ‌شدند تا اولین نشانه‌های جوشیدن آشکار شد. در این حالت محلول‌ها از روی حرارت برداشت شده و فوراً باکاغذ صافی واتمن 42 صاف گردیدند. محلول‌های صاف شده جهت آبگیری به بن‌ماری 60- 50 درجه سانتی‌گراد انتقال یافتند تا حالت ژله‌ای (نیمه جامد) در عصاره‌ها ایجاد شوند. سپس عصاره‌ها در حلال مناسب (آب مقطر استریل) حل گردیدند و تا زمان استفاده داخل یخچال قرار داده شدند.⁽¹⁴⁾

گروه‌های مختلف دهانشویه‌های مرکب گیاهی: در این مطالعه، 5 گروه مختلف از دهانشویه‌های مرکب برای آزمایش حساسیت ضدقارچی تهیه شدند. دهانشویه‌های تحت مطالعه به قرار ذیل بودند: شماره 1: اسانس زیره‌ی سبز (1 میکرولیتر، 34/3 درصد) + عصاره‌ی‌ آبی چای سبز (21 میکرولیتر، 70 درصد) + عصاره‌ی‌ آبی بادرنجبویه (8 میکرولیتر، 66/26 درصد)، شماره 2: اسانس زیره‌ی سبز (5/1 میکرولیتر، 5 درصد) + عصاره‌ی‌ آبی چای سبز (5/20 میکرولیتر، 34/68 درصد) + عصاره‌ی‌ آبی بادرنجبویه (8 میکرولیتر، 66/26 درصد)، شماره 3: اسانس زیره‌ی سبز (3 میکرولیتر، 10 درصد) + عصاره‌ی‌ آبی چای سبز (19 میکرولیتر، 34/63 درصد) + عصاره‌ی‌ آبی بادرنجبویه (8 میکرولیتر، 66/26 درصد)، شماره 4: اسانس زیره‌ی سبز (6 میکرولیتر، 20 درصد) + عصاره‌ی‌ آبی چای سبز (16 میکرولیتر، 34/53 درصد) + عصاره‌ی‌ آبی بادرنجبویه (8 میکرولیتر، 66/26 درصد)، شماره 5: اسانس زیره‌ی سبز (12 میکرولیتر، 40 درصد) + عصاره‌ی‌ آبی چای سبز (10 میکرولیتر، 34/33 درصد) + عصاره‌ی‌ آبی بادرنجبویه (8 میکرولیتر، 66/26 درصد). جهت تهیه دهانشویه‌های مرکب، درصدهای مختلف اسانس و عصاره‌ها با یکدیگر مخلوط شدند و سپس با دستگاه ورتکس همگن گردیدند و تا زمان انجام آزمایش در یخچال نگهداری گردیدند.

آزمایش چاهک‌گذاری (Punched-Whole Test): در این مطالعه حساسیت ضدقارچی اسانس زیره‌ی سبز، عصاره‌های آبی چای سبز و بادرنجبویه و 5 نوع دهانشویه مرکب بر علیه سویه‌ی استاندارد کاندیدا‏آلبیکنس با روش چاهک‌گذاری سنجش شدند.⁽¹⁵⁾ در ابتدا روی پلیت‌های حاوی سابورو دکستروز آگار (شرکت مرک، دارماستاد، آلمان) به ضخامت حدود 4 میلی‌متر، یک چاهک به قطر حدود 6 میلی‌متر ایجاد شد. سوسپانسیونی از کشت تازه‌ی کاندیدا در آب مقطر با کدورت معادل نیم مک فارلند (cfu/ml 10⁶×5-10⁶×1) تهیه گردید. با استفاده از سوآپ پنبه‌ای استریل آغشته به سوسپانسیون قارچی، سطح پلیت‌ها به طور یکنواخت تلقیح شدند. از هر اسانس مورد آزمایش، مقدار 30 میکرولیتر در داخل چاهک‌ها ریخته شد. پلیت‌ها به مدت 24 تا 48 ساعت در دمای بین
35-30 سانتی‌گراد در داخل گرم خانه قرار داده شدند. پس از گذشت زمان مورد نظر، تشکیل قطر هاله‌ی مهار رشد در پیرامون چاهک‌ها مورد بررسی قرار گرفت. قطر هاله‌ی مهار رشد قارچ با خط‌کش اندازه‌گیری گردید و نتایج حاصل نیز در جداول مربوطه وارد شدند. ضمناً از محلول دارویی ضدقارچ نیستاتین به عنوان کنترل مثبت آزمایش استفاده شد. آزمایش‌ها برای هر نمونه سه بار تکرار گردید.

روش تجزیه و تحلیل داده‌ها: برای به دست آوردن نتایج یکسان، آزمایش‌ها برای هر نمونه سه بار تکرار شدند و نتایج بر اساس انحراف معیار±میانگین محاسبه شدند. برای تعیین تفاوت بین گروه‌ها از نظر مهار رشد کاندیدا‏آلبیکنس از آنالیز واریانس یک‏طرفه  (One-way ANOVA) و آزمون تعقیبی توکی با کمک نرم‏افزار SPSS با ویرایش 16 استفاده شد. سطح معنی‌داری 05/0 در نظر گرفته شد.

یافته‌ها

همانگونه که در جدول 1 نشان داده شده است اسانس زیره‌ی سبز در آزمایش چاهک‌گذاری بعد از 48 ساعت، اثرات ضدقارچی قوی بر روی سویه‌ی استاندارد کاندیدا‏آلبیکنس نشان داد که میانگین قطر هاله‌ی مهاری ایجاد شده 33/40 میلی‌متر بود. عصاره‌ی آبی چای سبز در آزمایش چاهک‌گذاری بر روی سویه‌ی استاندارد کاندیدا‏آلبیکنس بعد از 48 ساعت، قطر هاله‌ای برابر با 33/6 میلی‌متر ایجاد کرده است. چنین به نظر می‌رسد که عصاره‌ی آبی چای سبز دارای اثرات ضدکاندیدایی نسبتاً ضعیفی می‌باشد. همچنین بر اساس نتایج حاصل از این آزمایش بر روی عصاره‌ آبی بادرنجبویه، مشخص گردید که این عصاره فاقد اثر ضدکاندیدایی است. آزمون آنالیز واریانس یک‏طرفه نشان داد که تفاوت معنی‌دار آماری بین نتایج اسانس زیره‌ی سبز و عصاره‌های چای سبز و بادرنجبویه وجود دارد (001/0P<، 588/1=F).

با توجه به تجربیات به دست آمده از طرح‌های تحقیقاتی گذشته و مقالات مرتبط با موضوع این تحقیق، 5 نوع دهانشویه با درصدهای مختلف تهیه شدند. نتایج آزمایش حساسیت ضدقارچی 5 دهانشویه مختلف در جدول 2 و تصویر 1 آورده شده است. طبق جدول 2، نتیجه آزمون آنالیز واریانس نشان داد میانگین میزان مهار رشد در دهانشویه‌های مورد مطالعه تفاوت معنی‌داری با یکدیگر داشتند (001/0P<، 911/184=F). همچنین در مقایسه دو به دوی گروه‌ها، نتیجه آزمون تعقیبی توکی نشان داد میانگین مهار رشد قارچ در دهانشویه مرکب شماره 1 با دهانشویه‌های شماره‌های 3، 4، 5، 6 و دهانشویه مرکب شماره 2 با دهانشویه‌های شماره‌های 3، 4، 5، 6 و دهانشویه مرکب شماره 3 با دهانشویه‌های شماره‌های 1، 2، 5، 6 و دهانشویه مرکب شماره 4 با دهانشویه‌های شماره‌های 1، 2، 5، 6 و دهانشویه مرکب شماره 5 با دهانشویه‌های شماره‌های 1، 2، 3، 4 و همچنین داروی نیستاتین با دهانشویه‌های شماره‌های 1، 2، 3، 4 تفاوت معنی‌داری داشتند (001/0P<). اختلاف معنی‌دار آماری بین داروی نیستاتین و دهانشویه‌ مرکب شماره 5 مشاهده نگردید (تصویر 2).

جدول 1 : نتایج حاصل از آزمایش چاهک‌گذاری بر روی عصاره‌ها‌ی آبی و اسانس گیاهان مورد مطالعه.

جدول 2 : نتایج حاصل از آزمایش چاهک‌گذاری بر روی دهانشویه‌های مرکب شماره‌های 1 تا 5.

تصویر 1 : تشکیل هاله‌ی عدم مهار رشد در آزمایش چاهک‌گذاری دهانشویه‌ شماره 5.

تصویر 2 : مقایسه‌ی دهانشویه‌ مرکب شماره 5 (B)و داروی نیستاتین (A).