تاثیرات سیتوتوکسیک میرتازاپین بر لنفوسیت های خونی از طریق شمارش میتوتیک ایندکس، شاخص تقسیم هسته ایی و پرولیفراسیون ایندکس

مقدمه

افسردگی یکی از ناهنجاری های جوامع امروزی است که با خلق پایین و کاهش  لذت و علاقه مشخص می شود و با علائمی مانند اختلال در خواب، تغییرات اشتها،  کاهش انرژی، احساس گناه ، عدم تمرکز و بی ارزش بودن ظاهر می شود (1). بر اساس مطالعات انجام شده تخمین زده می شود  25 % از خانمها و %15 از آقایان در طول زندگی خود دچاراین بیماری می شوند (2). داروهای ضد افسردگی در دهه ی سال های 1950 برای درمان افسردگی وارد بازار شدند و آمفتامین ها اولین موادی بودند که برای درمان افسردگی های ماژور مورد استفاده قرار گرفتند (3). یکی از این داروها که در حال حاضر مورد استفاده قرار می گیرد دارویی به نام میرتازاپین است. میرتازاپین موجب افزایش سطح سروتونین و آدرنالین در مغز می شود و از این طریق کاهش این دو را که موجب بوجود آمدن افسردگی می شود را جبران می کند (4). میرتازاپین با بلوکه کردن اتورسپتورهای آلفا-2 موجب ترشح نورآدرنالین می شود و افزایش نورآدرنالین موجب تحریک آدرنورسپتورهای آلفا-1 در سطح نرون شده و این تحریک موجب فعالیت سرتونرژیکی شده و طی آن 5HT(5-Hydroxytryptamine) ترشح می شود (5، 6). اکثر مطالعاتی که  در ارتباط با میرتازاپین صورت گرفته است در زمینه ی رفتاری، فیزیولوژیکی و عصبی است و پژوهش هایی  در مورد تاثیر این دارو در چرخه ی سلولی و یا تاثیر مستقیم آن در DNA در دسترس نمی باشد (7-9). از جمله مطالعات معدودی  که در این زمینه انجام شده است مربوط به پژوهش انجام شده توسط پان1 و همکاران می باشد که در مورد تاثیر میرتازاپین بر سلول های سرطانی استئوسارکومای انسانی است که بر اساس نتایج حاصل از آن پژوهش, میرتازاپین دارای اثر سیتوتوکسیک در سلول های سرطانی است (10). در نتیجه ضروری است که در این زمینه تحقیقات بیشتری صورت گیرد. همچنین افزایش مصرف دارو های ضد افسردگی در سالهای اخیر ضرورت مطالعات بیشتر در این زمینه را الزامی می سازد. از این رو دراین پژوهش اثر سیتوتوکسیسیته ی میرتازاپین در لنفوسیت های خونی از طریق شمارش میتوتیک ایندکس، پرولیفراسیون ایندکس و شاخص تقسیم هسته ایی مورد بررسی قرار گرفت.

روش کار

این تحقیق در دپارتمان بیوتکنولوژی دانشگاه چکوروای ترکیه انجام شد. در این پژوهش که به صورت خارج از بدن موجودات زنده (in vitro ) انجام شد میرتازاپین از شرکت Schering-plough خریداری شد واز خون هپارنیزه 4 نفر که دارو , سیگار مصرف نمی کردند (دو نفر آقا و دو نفر خانم با رده سنی 23-26 سال) استفاده شد. بدین صورت که ml 2/0 از خون هپارنیزه  در ml 5/2محیط کشت PB Max در ⁰C37 و  به مدت 72 ساعت در شرایط کاملا استریل کشت داده شد و محیط کشت نیز با استفاده از فیلتر های استریل با پرزهای μm 0.2  استریل گردید (11). قبل از انجام پژوهش برای پی بردن به این که چه دوز هایی در آزمایش مورد استفاده قرار گیرد روش به دست آوردن LD50 توسط میرتازاپین به کار برده شد  به صورتی که سلول های خونی در 8 تیوب 72 ساعت کشت داده شدند و 48 ساعت بعد از کشت لنفوسیت ها به هر تیوب مقدار های متفاوت از میرتازاپین اضافه شد و سلول های خونی 24 ساعت با میرتازاپین تیمار شدند و سپس لنفوسیت های همه ی نمونه ها برداشت شد و بعد از رنگ آمیزی با گیمسا %5 شمارش میتوتیک ایندکس انجام شد و دوز های 10، 25، 40، 55  μg/ml برای این مطالعه  انتخاب شدند. با به دست آوردن مقدار دوز های مورد استفاده از 4 نفر خون گیری انجام شد و خون این افراد به مدت 72 ساعت کشت داده شد. در این مطالعه لنفوسیت های خونی در سیکل های 24 و 48 ساعته تحت تیمار با  میرتازاپین قرار گرفتند و برای هر آزمایش از یک شاهد و یک کنترل مثبت (μg/ml 15 میتومیسین C) استفاده شد (12).

نمونه های مورد بررسی بدین صورت نام گذاری شدند:

کنترل (C): تحت تیمار با هیچ ماده ای قرار نگرفت.

کنترل مثبت 24 ساعته: 24 ساعت تحت تیمار با MMC μg/ml 15.

گروه 1 : 24 ساعت تحت تیمار با μg/ml10 میرتازاپین.

گروه 2: 24 ساعت تحت تیمار با μg/ml25  میرتازاپین.

گروه 3: 24 ساعت تحت تیمار با μg/ml40 میرتازاپین.

گروه 4: 24 ساعت تحت تیمار با μg/ml55 میرتازاپین.

کنترل مثبت 48 ساعته: 48 ساعت تحت تیمار با MMC μg/ml 15.

گروه 5: 48 ساعت تحت تیمار با μg/ml10 میرتازاپین.

گروه 6: 48 ساعت تحت تیمار با μg/ml25  میرتازاپین.

گروه 7: 48 ساعت تحت تیمار با μg/ml40 میرتازاپین.

گروه 8: 48 ساعت تحت تیمار با μg/ml55 میرتازاپین.

کشت لنفوسیت به منظور شمارش میتوتیک ایندکس (MI) و پرولیفراسیون ایندکس (PI):

بدلیل آنکه بررسی ناهنجاری های کروموزومی در مرحله متافاز از سیکل سلولی انجام می گیرد از این رو در 2 ساعت مانده به برداشت لنفوسیت ها (70 ساعت بعد از کشت) همه ی تیوب ها 2 ساعت تحت تیمار با 0.06 μg/ml  کلشی سین قرار گرفتند. درپایان 72 ساعت, تیوب ها جمع آوری شد و تیوب ها برای 5 دقیقه درrpm 1200 سانتریفیوژ شدند و سوپرناتانت دور ریخته شد و به قسمت پلت تیوب ها KCL 37 ⁰C  4/0% اضافه شد (ml5) و سپس 10 دقیقه درrpm 1000 سانتریقیوژ شد. به منظور فیکس کردن لنفوسیت ها از ml5 فیکساتیو سرد (4 ⁰C) که از اسیتیک اسید و متانول به نسبت 3:1 تهیه شده بود استفاده شد و تیوب ها به مدت 20 دقیقه در دمای اتاق نگهداری شدند و سپس 10 دقیقه درrpm 1000 سانتریقیوژ شدند و سوپر ناتانت دور ریخته شد. مرحله فیکسه کردن لنفوسیت ها دوباره تکرار شد و این مرحله  تا زمان بوجود آمدن مایع کاملا شفاف 2 بار تکرار شد و در نهایت سوپرناتانت دور ریخته شد و قسمت پلت تیوب ها که حاوی لنفوسیت بود توسط پیپت پاستور از 30 سانتیمتری به لامهای سرد پرتاب شد (هر لام 5 قطره) و 24 ساعت در دمای اتاق به منظور خشک شدن نگهداری شد.

رنگ آمیزی لامها برای شمارش میتوتیک ایندکس

رنگ آمیزی لامها 13 دقیقه و با استفاده از گیمسای %5 (ml5 تامپونA  ml+5 تامپون+ B  ml5 گیمسا محصول شرکتMerck  +ml 85  آب) انجام شد (13). سپس لامها به منظور خشک شدن 24  ساعت در دمای اتاق نگهداری شدند.

بررسی میکروسکوپی

بعد از خشک شدن لامها بررسی های میکروسکوپی در میکروسکوپ   Olympus و در بزرگنمایی 400  انجام شد.  به منظور بررسی سیتوکسیسیتی میرتازاپین در هر نمونه 3000 عدد  سلول های لنفوسیت شمارش شد و تعداد لنفوسیت هایی که در مرحله متافاز بودند ثبت شد و میتوتیک ایندکس از طریق این فرمول حساب شد:

14Mitotic index=ظ…طھط§ظپط§ط²غŒ ظ‡ط§غŒ ظ„ظ†ظپظˆط³غŒطھ طھط¹ط¯ط§ط¯3000'>

کشت لنفوسیت و رنگ آمیزی آن به منظور شمارش شاخص میانگین تقسیم هسته ای (NDI):

44 ساعت بعد از کشت لنفوسیت ها به منظور ممانعت از سیتوکینز μg/ml6 سیتوکالاسین D محصول شرکت سیگما به محیط کشت حاوی لنفوسیت ها اضافه شد و سلول ها تا پایان ساعت 68 در  ⁰C37 انکوبه گردیدند. درپایان ساعت 68 ام تیوب ها به مدت 5 دقیقه درrpm 1200 سانتریفیوژ گردید و سوپرناتانت دور ریخته شد و به قسمت پلت تیوب ها0.4% KCL 37 ⁰C  اضافه شد (ml5) و این بار 10 دقیقه درrpm 1000 سانتریقیوژ شد. سپس از محلول فیکساتیو (اسیتیک اسید, متانول و  NaCl 9/0% به نسبت 6:5:1) برای فیکسه کردن لنفوسیت ها استفاده شد و در نهایت لنفوسیت ها توسط پیپت پاستور از 10 سانتیمتری به لامهای سرد پرتاب شد (هر لام 5 قطره) و 24 ساعت در دمای اتاق به منظور خشک شدن نگهداری شد (14).

رنگ آمیزی لامها

 رنگ آمیزی لامها 13 دقیقه و با استفاده از گیمسای %5 (ml5 تامپونA  ml+5 تامپون+ B  ml5 گیمسا محصول شرکتMerck  +ml 85  آب) انجام شد. به منظور خشک شدن, لامها 24 ساعت در دمای اتاق نگهداری شدند.

بررسی میکروسکوپی

بعد از خشک شدن لامها بررسی های میکروسکوپی با میکروسکوپ   Olympus و در بزرگنمایی 400 انجام گرفت.  بدین منظور تعداد سلول های یک, دو, سه و چهار هسته ای  به ازای 1000 سلول در هر نمونه شمارش شد و شاخص (NDI) از این طریق محاسبه شد (15):

  14NDI=F1+2F2+3F3+4(F4)n'>

در فرمول بالا F4, F3, F2, F1  به ترتیب نشان گر تعداد سلول های یک هسته ای, دو هسته  ای, سه هسته ای , چهار هسته ای و 14 n'>  نیز سلول های شمارش شده در هر نمونه را مشخص می کند.

کشت لنفوسیت و رنگ آمیزی آن به منظور شمارش پرولیفراسیون ایندکس (PI)

همزمان با شروع کشت سلول های خونی برای تشخیص اینکه هر لنفوسیت چند بار تقسیم میتوز انجام داده هست به همه ی تیوب ها مقدار  μg BrdUrd/ml10 اضافه شد (16). بدلیل آنکه شمارش پرولیفراسیون ایندکس در مرحله متافاز از سیکل سلولی انجام می گیرد از این رو لنفوسیت ها 2 ساعت (70 ساعت بعد از کشت) تحت تیمار با 0.06 μg/ml   کلشی سین قرار گرفتند. برای برداشت لنفوسیت ها در این مرحله همانند روش برداشت لنفوسیت ها برای شمارش میتوتیک ایندکس عمل شد.

رنگ آمیزی لامها

 برای رنگ آمیزی لامها به منظور بررسی پرولیفراسیون ایندکس از روش Speit  و  Haupter استفاده شد (17). بدین طریق که ابتدا لام ها  در داخل بافر 3/0 مولار کلرید سدیم و 03/0 مولار سیترات سدیم غوطه ور شدند و به مدت 30 دقیقه  از فاصله 15 سانتیمتری, لامپ UV با طول موج 254 nm  بر لامها تابانده شد و پس از پایان این مدت لام ها در داخل بافر 1X SCC قرار گرفتند و به مدت 1 ساعت در دمای 58 درجه سانتیگراد در داخل بن ماری قرار داده شدند و به محض اتمام این مرحله لامها به مدت 8 دقیقه و با استفاده از گیمسای %5 (ml5 تامپونA  ml+5 تامپون+ B  ml5 گیمسا محصول شرکتMerck  +ml 85  آب) رنگ آمیزی شدند. سپس لامها به منظور خشک شدن 24  ساعت در دمای اتاق نگهداری شدند.

بررسی میکروسکوپی

بعد از خشک شدن لامها بررسی های میکرو سکوپی در میکروسکوپ   Olympus و در بزرگنمایی 400  انجام شد.  به منظور بررسی سیتوکسیسیتی میرتازاپین در هر نمونه 100 عدد  سلول های لنفوسیت شمارش شد و تعداد لنفوسیت هایی که یک, دو و یا سه بار مرحله میتوز را گذرانده بودند ثبت شد و پرولیفراسیون ایندکس از طریق این فرمول حساب شد:

14proliferation index=M1+2(M2)+3(M3)100'>

در فرمول بالا M3, M2, M1به ترتیب نشان گر تعداد سلول هایی که یک بار, دوبار و سه بار وارد میتوز شده اند میباشد.در شکل 3 سلول هایی که یک بار, دوبار و سه بار وارد میتوز شده اند نشان داده شده است.

داده های بدست آمده از طریق آزمون تی و در برنامه16  Minitab مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت (18).

نتایج

در این آزمایش برای اطمینان از صحیح بودن مراحل انجام آزمایش از ماده میتومیسین C که یک ماده ی کارسینوژن می باشد (19) استفاده شد و نتایج به دست آمده از مقایسه ی نمونه های تیمار شده با میتومیسین C و گروه شاهد تفاوت بسیاری معنی داری را نشان داد که وجود این تفاوت حاکی از صحیح بودن روش کار می باشد (19). سیتوتوکسیک بودن یا نبودن میرتازاپین بر روی لنفوسیت های خونی در چهار دوز مختلف یک بارتحت تیمار 24 ساعته و یک بارتحت تیمار 48 ساعته و با روش های میتوتیک ایندکس، شاخص تقسیم هسته ایی و پرولیفراسیون ایندکس بررسی شد که نتایج حاصل از میانگین شمارش میتوتیک ایندکس، شاخص تقسیم هسته ایی و پرولیفراسیون ایندکسدر جدول شماره 1 نشان داده شده است. تجزیه تحلیل داده ها درمورد  MI (میتوتیک ایندکس) نشان از آن داشت که تیمار لنفویست ها با میرتازاپین به غیر از دوز µg/ml 25 در همه ی نمونه ها موجب کاهش میانگین MI شده است و این کاهش از لحاظ آماری معنی دار بوده است. از طرفی در تیمار های 24 ساعته کاهش میتوتیک ایندکس با افزایش دوز میرتازاپین رابطه ی مستقیم داشته است که این ارتباط به صورت یک نمودار در نمودار1 نشان داده شده است. تجزیه تحلیل داده ها درمورد NDI نشان از آن داشت که تیمار لنفویست ها با میرتازاپین موجب کاهش میانگین NDI در همه ی نمونه های تیمار شده اعم از تیمار24 ساعته و تیمار 48 ساعته شده است و این کاهش از لحاظ آماری معنی دار می باشد و اما در مورد پرولیفراسیون ایندکس، نتایج به دست آمده نشان داد که تیمار لنفوسیت ها با میرتازاپین موجب کاهش پرولیفراسیون ایندکس در همه ی نمونه ها شده است و به جز در مورد دوزهای µg/ml 10 و µg/ml 25 در همه ی نمونه ها این کاهش از لحاظ آماری معنی دار بوده و هم در مورد تیمار 24 ساعته و هم درمورد تیمار 48 ساعته افزایش دوز تیمار شده با کاهش پرولیفراسیون ایندکس رابطه ی مستقیم داشته است که این ارتباط در نمودار های 2و3  نشان داده شده است.

بحث

تجزیه تحلیل آماری  نشان داد که میرتازاپین موجب کاهش پرولیفراسیون ایندکس در همه ی نمونه ها شده و این کاهش از لحاظ آماری معنی دار می باشد و افزایش طول زمان تیمار از 24 ساعت به 48 ساعت نیز مرتبط با کاهش پرولیفراسیون است و با  افزایش زمان تیمار این کاهش شدیدتر می شود. با مروری بر نتایج حاصل از مطالعه ی سیتوتوکسیسیتی دارو های ضد افسردگی می توان نتیجه گرفت که بعضی از این داروها دارای اثرات سیتوتوکسیک می باشند ولی در مقابل هستند برخی از داروهای ضد افسردگی که دارای اثرات سیتوتوکسیک نمی باشند. مثلا در پژوهشی تاثبرات سیتوتوکسیک داروی آمیتریپتیلین در لنفوسیت های خونی بررسی شده است که بر اساس نتایج به دست آمده از این پژوهش آمیتریپتیلین دارای اثرات سیتوتوکسیک نبوده و افزایش دوز دارو نیز تاثیری بر میتوتیک ایندکس نداشته است (20). ولی هستند برخی از داروهایی که دارای اثرات سیتوتوکسیک می باشند. پژوهشی که از طرف ساکسنا1 و همکاران صورت گرفته بود در آن اثر سیتوتوکسیسیتی داروی ضد افسردگی ایمیپرامین از طریق روش شمارش پرولیفراسیون ایندکس بررسی شده بود و در در آن پژوهش ایمیپرامین موجب کاهش پرولیفراسیون ایندکس در لنفوسیت های خونی شده بود  که نتایج حاصل از این پژوهش با نتایج ما هم خوانی دارد (20). تجزیه تحلیل داده ها درمورد میانگین میتوتیک ایندکس نشان داد که میرتازاپین موجب کاهش میتوتیک ایندکس در همه ی نمونه ها شده و این کاهش از لحاظ آماری معنی دار است. پرز2 و همکاران پژوهشی در رابطه با تاثیر داروی ضد افسردگی، دسیپرامین را در سلول های مغز استخوان موش ها بررسی کرده بودند و نتیجه ی حاصل از آن پژوهش نشان داد که دسیپرامین موجب کاهش میتوتیک ایندکس در موش ها می گردد. نتایج آن پژوهش با نتایج پژوهش حاضر همخوانی دارد (21). مطالعه دیگری که از طرف هانا3 و همکاران انجام شده بود در آن تاثیر اسیتالوپرام در لنفوسیت های خونی بررسی شد و نتایج حاصل از بررسی میتوتیک ایندکس نشان از آن داشت که اسیتالوپرام موجب کاهش میتوتیک ایندکس شده و این کاهش با افزایش دوز شدیدتر می شود. نتایج این پژوهش نشان داد که تیمار لنفوسیت ها با میرتازاپین در همه ی نمونه ها موجب کاهشNDI  شده است و افزایش زمان تیمار از 24 ساعت به 48 ساعت تاثیر به سزایی در کاهش NDI  نشان نداده است. بر اساس نتایج حاصل از پژوهش پان4 و همکاران میرتازاپین موجب افزایش Ca2+در سلول های سرطانی شده و از این طریق نقش سیتوتوکسیک در سلول های سرطانی استئوسارکومای انسانی را ایفا می کند (10) . شاید سیتوتوکسیک بودن میرتازاپین در لنفوسیت های خونی هم به همین دلیل باشد.

نتیجه گیری

 نتایج به دست آمده از این پژوهش که سیتوتوکسیک بودن میرتازاپین در لنفوسیت های خونی را نشان می دهد  احتمالا به خاطر دلیلی که پان و همکاران بیان کردند می باشد و از آنجایی که این ماده در آن پژوهش توانسته سلول سرطانی را به مسیر آپاپتوز هدایت نماید، از این رو لازم است مطالعات بیشتری بر این دارو انجام بگیرد تا شاید بتوان از سیتوتوکسیک بودن این ماده برای از بین بردن سلول های توموری استفاده کرد. به این دلیل که در این پژوهش میرتازاپین موجب اثرات سیتوتوکسیک در لنفوسیت های خونی شده است از این رو لازم به ذکر است که پزشکان محترم در انتخاب مقدار دوز این دارو دقت نموده و در صورت امکان  داروهای جایگزین این دارو مثل بوپراپیون که دارای کمترین اثر سیتوتوکسیک هست (22) را تجویز بفرمایند.