مقدمه

کیست‌ها و تومورهای ادنتوژنیک بخش مهمی از ضایعات فکی و دهانی هستند که از بقایای اپی‌تلیوم ادنتوژنیک در مراحل مختلف ادنتوژنزیس به وجود می‌آیند. کیست‌های دندانی اصولا به دو دسته اصلی کیست‌های التهابی و رشدی تکاملی تقسیم گردیده و رفتارهای بیولوژیک متنوعی دارند.⁽¹⁾ کیست دنتی‌ژروس شایع‌ترین کیست رشدی نموی ادنتوژنیک است که بیش از 20 درصد کیست‌های مفروش از اپی‌تلیوم فک را تشکیل می‌دهد.⁽¹⁾ این کیست از جدایی فولیکول از اطرف تاج دندان رویش نیافته به وجود می‌آید.^(2و1) هرچند در برخی از موارد به نظر می‌رسد که این کیست منشأ التهابی داشته باشد.⁽¹⁾ همانند کیست‌های دیگر، بزرگ شدن کیست دنتی‌ژروس در رابطه با پرولیفراسیون اپی‌تلیال، فاکتورهای تحلیل برنده استخوان و افزایش فشار اسمزی مایع داخل کیست ایجاد می‌شود. این کیست‌ها گاهی تا اندازه‌ای بزرگ می‌شوند که باعث ناقرینگی صورت می‌گردند.⁽¹⁾ احتمال تبدیل کیست دنتی‏ژروس به نئوپلاسم وجود دارد که از جمله این موارد، تغییر نئوپلاستیک پوشش کیست به یک آملوبلاستوما، به ندرت کارسینوم سلول سنگفرشی و کارسینوم موکواپیدرمویید می‌باشد. ⁽¹⁾

ادنتوژنیک کراتوسیست شکل مشخصی از یک کیست رشدی تکاملی می‌باشد که به علت تظاهرات هیستوپاتولوژیک خاص و رفتار کلینیکی با تهاجم موضعی و عودهای مکرری که دارد توجه خاصی را به خود معطوف کرده است.⁽¹⁾ OKC بیش از 3 تا 11 درصد کل کیست‌های ادنتوژنیک را تشکیل می‌دهد. این کیست مکانیسم رشد و رفتار بیولوژیکی متفاوتی را نسبت به کیست‌های شایع‌تر نظیر دنتی‌ژروس و رادیکولار نشان می‌دهد و ممکن است رشد آن به فاکتورهای ناشناخته ذاتی در اپی‌تلیوم یا فعالیت آنزیماتیک در دیواره فیبروزه کیست ارتباط داشته باشد.⁽¹⁾ از جمله مکانیسم‌های رشد OKCها، میزان پرولیفراسیون (تکثیر) بالا، افزایش بیان پروتئین آنتی‌آپوپتوتیک BCL-2 و بیان ماتریکس متالوپروتئینازها (MMP_2,9) می‌باشد.⁽²⁾ به غیر از تمایل به عود به طور کلی پیش‌آگهی اکثر OKCها خوب است. این کیست‌ها در آخرین طبقه‌بندی تومورهای ادنتوژنیک WHO (World Health Organization)، کراتوسیستیک ادنتوژنیک تومور نام گرفته‌اند.⁽¹⁾ پیشروی منظم سلول‏ها از مراحل مختلف چرخه سلولی توسط کینازهای وابسته به سیکلین (CDK_S) بعد از اتصال این کینازها به خانواده دیگری از پروتئینها موسوم به سیکلین‏ها سازماندهی می‏شود. پروتئین‏هایی که باعث مهار تکثیر سلولی می‏شوند، محصولات ژن‏های سرکوب کننده تومور هستند.⁽³⁾ P₅₃ که به عنوان ژن سرکوبگر تومور شناخته می‌شود، فاکتور تنظیم‌کننده مسیرهایی نظیر ترمیم DNA، سیکل سلولی، آپوپتوز، آنژیوژنز و حفظ ثبات ژنومی می‌باشد.^(4و3) P₅₃ به صورت منفی به وسیله تقابل با انکوپروتئین MDM₂ تنظیم می‌گردد.^(4و3) ژن MDM₂ که به عنوان یک انکوژن شناخته می‌شود دارای دو عامل فعال‌کننده رونویسی به نام P₁ و P₂ می‌باشد که P₂ وابسته به P₅₃ می‌باشد.⁽⁴⁾ در حالت نرمال MDM₂ در هسته تولید می‌شود ولی جهت فعال کردن تنزل (Degradation) عوامل هدف خود به وسیله پروتئازوم‌ها به سیتوپلاسم منتقل می‌شود.⁽⁴⁾ مطالعات مختلفی جهت بررسی رابطه بین MDM₂و P₅₃ در ضایعات مختلف صورت گرفته است اما بررسی‏های اندکی این مطالعات را در کیست‏ها و تومورهای ادنتوژنیک انجام داده‏اند.^(6و5) لذا هدف از این مطالعه بررسی بروز نشانگرهای MDM₂ و P₅₃ که به عنوان شاخص‌های مهم تکثیر و تنظیم سیکل سلولی می‏باشند، در ادنتوژنیک کراتوسیست و کیست دنتی‏ژروس بود، تا شاید بتوان کیست‌هایی را که دارای پتانسیل بیشتری برای تغییرات نئوپلاستیک هستند را مشخص کرده و توانایی بروز رفتارهای گوناگون آنها را توجیه نمود.

مواد و روش‏ها

در این مطالعه توصیفی – تحلیلی به روش مقطعی، 30 بلوک پارافینه شامل 15 بلوک ادنتوژنیک کراتوسیست و 15 بلوک کیست دنتی‏ژروس از آرشیو دانشکده دندانپزشکی مشهد و همدان به منظور رنگ آمیزی ایمونوهیستوشیمی با مارکرهای P_{53 و} MDM₂ انتخاب شدند. برای تعیین تعداد نمونه از رابطه حجم نمونه در دو گروه به صورت زیر  و اطلاعات مقاله شریفی سیستانی و همکاران⁽⁵⁾ استفاده شد.با در نظر گرفتن خطای نوع اول 5 درصد و توان 80 درصد تعداد نمونه لازم در هر گروه برابر 15 به دست آمد. بلوک‌ها توسط دو پاتولوژیست به طور کامل بررسی شدند و نمونه‏هایی که دارای میزان کافی از ضایعه به منظور رنگ‌آمیزی ایمونوهیستوشیمی بوده و فاقد التهاب یا دارای التهاب اندک بودند و فیکساسیون مطلوب داشتند، انتخاب شدند. نمونه‏هایی که فاقد مشخصات فوق بودند از مطالعه خارج شدند. ضمناً اطلاعات بالینی نظیر سن، جنس و محل ضایعه از پرونده بیماران استخراج گردید. پس از انتخاب بلوک‌های پارافینی، از هر بلوک پارافینی دو برش به ضخامت 5 تا 6 میکرون تهیه و به روش ایمونوهیستوشیمی از مارکرهای P₅₃ (مونوکلونال موشی ضد P₅₃،DAKO/clone DO-7/IS 616، ساخت دانمارک) و MDM₂ (مونوکلونال موشی ضد ,MDM₂Novocastra ساخت انگلستان) طبق دستورالعمل سازنده برای رنگ‌آمیزی نمونه‌ها استفاده شد.پس از تهیه برش‌های بافتی و قرار دادن آن بر روی اسلایدها، به وسیله گزیلن، پارافین‌زدایی و با الکل‌های درجه‌بندی شده آبدهی شدند. سپس جهت بازیافت آنتی‌ژن از دستگاه ماکروویو در دمای ^oC95 و مدت زمان 25 دقیقه استفاده شد. پس از شستشو با PBS (Phosphate buffered saline) از آنتی‌بادی اولیه و آنتی‌بادی ثانویه استفاده شد، که هر دو مارکر با توجه به اینکه آماده استفاده بودند، رقیق نشدند، و سپس انکوباسیون انجام شد. در مرحله بعد ماده رنگ‌زای DAB استفاده و در مرحله بعد برش‌ها با هماتوکسیلین Counterstein و در مرحله آخر Mounting صورت گرفت. اسلایدهای رنگ‌آمیزی شده زیر میکروسکوپ نوری (Olympus Bx41) ساخت ژاپن با درشت‌نمایی 400 و 100 برابر تحت مطالعه قرار گرفت، سلول‌های مثبت رنگ گرفته، سلول‌هایی که هسته آنها قهوه‌ای رنگ گرفته بودند برای شمارش انتخاب شد. ابتدا با بزرگنمایی 100 برابر مناطقی که بیشترین رنگ‌پذیری را داشتند مشخص شدند و سپس با بزرگنمایی 400 برابر، پنج منطقه که بیشترین تعداد سلول‌های اپی‌تلیال رنگ پذیرفته  (Hot spot) (با استفاده از مارکر P_{53 و} MDM₂) را داشتند در لایه بازال و 5 منطقه در لایه‌های سوپرابازال انتخاب شدند⁽⁵⁾ از این مناطق توسط دوربین دیجیتال DP₁₂ مدل XC-3UTV0.5 عکس تهیه گردید و با شاهد مثبت که برای هر دو مارکر (Breast interaductal carcinoma)  در نظر گرفته شده بود مقایسه شد. سپس با استفاده از برنامه Analysis LS starter تعداد سلول‌های رنگ‌آمیزی شده در این مناطق توسط دو پاتولوژیست شمارش و میانگین آنها گرفته ‌شد. میزان همبستگی بین دو پاتولوژیست برابر 9/0 بوده است. در این مطالعه بررسی نیمه کمی نیز انجام شد، به این نحو که نمونه‌هایی که کمتر از 5 درصد سلول‌های اپی‌تلیالی رنگ گرفته‌ بودند (±)، نمونه‌هایی که بین 25-5 درصد سلول‌های اپی‌تلیالی رنگ گرفته‌ بودند (+) و آنهایی که 25%< رنگ‌پذیری نشان دادند (++)، در نظر گرفته شدند.⁽⁵⁾ شدت رنگ پذیری در این مطالعه چشمی و به صورت خفیف، متوسط و شدید ارزیابی شد.در این مطاله از آزمون t-studentو Chi-squareبرای بررسی داده‏ها استفاده شد و (P≤0.05) در نظر گرفته شد. برای تحلیل داده‎ها نرم افزار SPSS با ویرایش 16 به‎کار رفت.

یافته‏ ها

همانطور که در جدول 1 مشخص شده است بین سن و جنس و محل ضایعات در گروه‏های مورد مطالعه اختلاف آماری معنی داری وجود نداشت.در این مطالعه، بروز P₅₃ و MDM₂در تمامی نمونه‏های ادنتوژنیک کراتوسیست و کیست دنتی‏ژروس دیده شد. بروز هر دو مارکر در ادنتوژنیک کراتوسیست بیشتر از کیست دنتی‏ژروس بود، که بروز در لایه‏های سوپرابازال بیشتر از لایه بازال بود (تصاویر  1تا 4) و این در حالیست که در ادنتوژنیک کراتوسیست بروز MDM₂ نسبت به P₅₃ دارای تفاوت قابل ملاحظه ای هم در لایه بازال و هم سوپرابازال بود که داده‏های مربوط به هر ضایعه در جدول 2 آورده شده است. بر اساس داده‏های بدست آمده رابطه بینP_{53 و} MDM₂ همسو بود (45/0r= و 013/0P=) مقایسه نیمه کمی برای میزان بروز این دو مارکر در کیست‏های مورد مطالعه نیز نشان دهنده بروز بیشتر P₅₃و MDM₂ در ادنتوژنیک کراتوسیست بود ولی این تفاوت از لحاظ آماری معنی‎دار نبود، که به ترتیب (051/0P=) و (34/0P=) به دست آمد. (جدول 3) بررسی‏های کیفی الگوی رنگ‏پذیری نشان داد که با مارکر P₅₃ در گروه ادونتوژنیک کراتوسیست‏ها پترن غالب رنگ‏پذیری متوسط و در گروه کیست‏های دنتی‏ژروس، خفیف بود، با مارکر MDM₂ در گروه OKC، و دنتی‏ژروس پترن غالب رنگ‏پذیری شدید بود و از آزمون همبستگی و آماره t برای ارزیابی ارتباط بین متغیرها استفاده شد.

جدول 1 : اطلاعات بالینی مربوط به سن،جنس و مکان در گروه‏های تحت مطالعه

جدول 2 :توزیع فراوانی مارکرهای P₅₃وMDM₂در گروه‏های مورد مطالعه

DC= کیست دنتی‏ژروس

OKC= ادنتوژنیک کراتوسیست

جدول 3 : توزیع فراوانی مارکرهای  P₅₃و MDM₂

تصویر 1 : رنگ آمیزی ایمونوهیستوشیمی با استفاده از نشانگر P₅₃ در ادنتوژنیک کراتوسیست (با شدت رنگ پذیری متوسط) (400Ï)

تصویر2 : رنگ آمیزی ایمونوهیستوشیمی با استفاده از نشانگرMDM₂در ادنتوژنیک کراتوسیست (با شدت رنگ پذیری خفیف)   (400Ï)

تصویر 3 : رنگ آمیزی ایمونوهیستوشیمی با استفاده از نشانگر P₅₃ در کیست دنتی‏ژروس (با شدت رنگ پذیری خفیف)  (400Ï)

تصویر 4 : رنگ آمیزی ایمونوهیستوشیمی با استفاده از نشانگرMDM₂در کیست دنتی‏ژروس (با شدت رنگ پذیری شدید)  (400Ï)