مقدمه

کیست‏های ادنتوژنیک بخش مهمی از ضایعات دهان و فک و صورت را تشکیل می‏دهند. کیست‏های تکاملی ادنتوژنیک از جمله ضایعات شایع تخریب کننده استخوان در ناحیه سر و گردن محسوب می‏شوند که پاتوژنز آنها دقیقاً مشخص نیست. کیست دنتی‏ژروس (فولیکولر)، شایع‏ترین کیست تکاملی ادنتوژنیک است که از جدا شدن فولیکول دندانی اطراف تاج یک دندان رویش نیافته به وجود می‏آید.⁽¹⁾

در میان کیست‏ها، ادنتوژنیک کراتوسیست به علت ویژگی‏های هیستوپاتولوژیک و مشی بالینی خاص مورد توجه قرار گرفته است.⁽¹⁾  ادنتوژنیک کراتوسیست، از جمله کیست‏های رشدی تکاملی ادنتوژنیک می‏باشد که ممکن است رفتار کلینیکی مهاجمی را نشان داده و دارای میزان عود بالایی باشد؛ چنانکه در طبقه‏بندی جدید سازمان بهداشت جهانی (WHO) تحت عنوان کراتوسیستیک ادنتوژنیک تومور نامگذاری شده است.⁽¹⁾ به نظر می‏رسد از میان سلول‏های التهابی، ماست‏سل‏ها نقش مهمی در پاتوژنز این ضایعات ایفا کنند، بدین صورت که این سلول‏ها می‏توانند سبب رشد تومور بوسیله آنژیوژنز شوند و همچنین قادر به رهاسازی سایتوکاین‏های آنژیوژنیک نظیر VEGF، FGF2، سرین پروتئازهای تریپتاز و کیماز، IL-8، TGF-β و TNF و NGF می‏باشند.^(3و2) از طرف دیگر آنژیوژنزیس برای رشد، تکامل و گسترش ضایعات، امری حیاتی به شمار می‏رود.⁽⁴⁾ مارکرهای مختلفی مانند CD34، CD31 و VEGF و ... جهت تعیین متوسط دانسیته (MVD) مورد استفاده قرار می‏گیرند.⁽⁵⁾ از جمله مارکرهای ایمنوهیستوشیمی که برای رنگ‏آمیزی عروق استفاده می‏شوند، آنتی CD34 می‏باشند.  
CD34 (cluster of differentiation molecule) یک نوع پروتئوگلیکان است که روی سلول‏های اندوتلیال و سلول‏های مغز استخوان قرار دارد و مارکری مناسب برای مطالعاتی است که کمیت آنژیوژنیک را در تومورها بررسی می‏کنند. CD31 می‏تواند به میزان کمتری سلول‏های فیبروبلاست و برخی از پلاسما‏سل‏ها را رنگ کند و به ندرت دارای تظاهر کاملاً قوی می‏باشد. CD34 دارای مشخصات CD31 بوده، ولی این پروتئین دارای بروز قوی و میزان شکست کم در رنگ‏پذیری نسبت به سایر مارکر‏ها مانند CD31 می‌باشد و نقش مهمی در ارزیابی تراکم عروق خونی کوچک در ضایعات مختلف دارد.^(8-5)

مطالعات مختلفی ارتباط ماست‏سل و آنژیوژنزیس را مورد بررسی قرار داده‏اند؛ به دلیل نتایج متناقض به دست آمده، هدف از این مطالعه بررسی ارتباط ماست‏سل‏های تریپتاز مثبت و آنژیوژنزیس با استفاده از مارکر CD34 در ادنتوژنیک کراتوسیست و کیست دنتی‏ژروس بود. در صورت وجود رابطه مثبت بین میزان بروز این پروتئین‏ها و رفتار متفاوت ادنتوژنیک کراتوسیست، شاید بتوان در آینده با بلوک و مهار کردن این پروتئین‏ها باعث کاهش فعالیت رگ‏زایی ضایعات با فعالیت آنژیوژنزیس بالا شد.

مواد و روش‏ها

در این مطالعه گذشته نگر توصیفی-تحلیلی به روش مقطعی، کلیه فایل‏های آرشیو دانشکده دندانپزشکی همدان از سال‏های 93-76 مورد بررسی قرار گرفت و پرونده بیماران با تشخیص ضایعات ادنتوژنیک شامل کیست دنتی‏ژروس و ادونتوژنیک کراتوسیست خارج شد. سپس بلوک‏های پارافینه و اسلایدهای نمونه‏های مربوط به کیست دنتی‏ژروس و ادنتوژنیک کراتوسیست خارج شد. پس از مشاهده اسلایدهای هماتوکسیلین-ائوزین توسط دو پاتولوژیست دهان و فک و صورت، و تایید تشخیص ضایعات مذکور، اسلایدهایی که دارای بافت کافی و فیکساسیون مناسب بودند، انتخاب شدند. جهت تعیین حجم نمونه از فرمول مقایسه میانگین‏های دو جامعه و از اطلاعات مطالعات مشابه با اطمینان 95 درصد و توان 80 درصد استفاده شد و تعداد حجم نمونه برای هر گروه 15 عدد به دست آمد.^(6و5) نمونه‏های با خونریزی و آماس زیاد و بافت ناکافی از مطالعه خارج گردیدند. اطلاعات بالینی مربوط به آنها، شامل سن، جنس و محل ضایعات از پرونده بیماران استخراج شد و ثبت گردید. سپس جهت رنگ‏آمیزی ایمونوهیستوشیمی برش 4 میکرونی از بلوک پارافینی تهیه گردید. این برش‏ها جهت پارافین زدایی در گزیلن و سپس برای آب گیری در الکل با درجات مختلف قرار گرفت و بعد از آن به منظور متوقف ساختن فعالیت پراکسیداز داخلی در محلول بافر فسفات و هیدروژن پراکسید 3 درصد انکوبه شد. پس از آن جهت بازیافت آنتی‏ژن نمونه‏ها برای CD34 در میکروویو (Panasonic,1380w) با فشار 2 اتمسفر در 120 درجه سانتی گراد به مدت 10 دقیقه قرار گرفته و برای تریپتاز نمونه‏ها در بافر سیترات با pH 6.0 در حمام آب با دمای 96 درجه سانتی گراد به مدت 30 دقیقه قرار گرفتند و به منظور جلوگیری از واکنش‏های غیراختصاصی نمونه‏ها توسط سرم 10 درصد به مدت 10 دقیقه انکوبه شدند و سپس تحت تاثیر آنتی‏بادی اولیه با Anti CD34 (Clone: QBend 10, Product code: M7165 A/S, Glostrup, DAKO, Denmark), Tryptase (monoclonal mouse anti-human mast cell tryptase, clone G3; Cell Marque Corporation, Rocklin, CA, USA;  با رقت ₂₀₀/¹) به مدت 30 دقیقه قرار گرفتند، بعد از آن به مدت 15 دقیقه تحت تاثیر آنتی‏بادی ثانویه، DAB، جهت واکنش رنگ‏پذیری، هماتوکسیلین مایرز به منظور رنگ‏پذیری زمینه قرار گرفتند. اسلایدها بعد از هر مرحله در بافر فسفات قرار داده شدند. بافت لوزه انسانی به عنوان شاهد مثبت در نظر گرفته شد و برای شاهد منفی آنتی‏بادی اولیه حذف و با PBS (Phosphate Buffered Saline) جایگزین گردید.^(10و9)

اسلایدهای رنگ‏آمیزی شده زیر میکروسکوپ نوری  (BX 41 Olympus, Japan) با درشت نمایی 400 و 100 برابر تحت مطالعه قرار گرفتند و با استفاده از مقایسه با نمونه شاهد مثبت (بافت لوزه انسان) از صحت رنگ‏آمیزی اطمینان حاصل گشت. ابتدا با بزرگنمایی 400 برابر، پنج منطقه که بیشترین تعداد ماست‏سل‏های رنگ‏آمیزی شده (با استفاده از مارکر تریپتاز) را داشت (Hot spot) انتخاب شدند و از این مناطق توسط دوربین دیجیتال (U-TV0/5 DP12 XC-3, Japan) سوار شده بر میکروسکوپ (Olympus BX 41, Japan) عکس تهیه گردید و سپس با استفاده از برنامه Analysis LS Starter (نرم افزار شمارش سلولی ساخت کشور ژاپن) تعداد سلول‏های رنگ‏آمیزی شده در این مناطق توسط پاتولوژیست‏های طرح شمارش و میانگین آنها گرفته شد.⁽⁸⁾ ارزیابی کمی عروق خونی طبق روش توصیف شده Weidner و همکاران⁽¹¹⁾ انجام شد. بدین ترتیب که در درشت نمایی پایین (40×)، 3 ناحیه که بیشترین واسکولاریته را نشان دادند (hot spot) انتخاب شدند و سلول‏های رنگ‏آمیزی شده، شمارش شدند.  پس از انجام تکنیک ایمونوهیستوشیمی برای مارکر CD34، هر سلول اندوتلیال قهوه‏ای رنگ به صورت منفرد یا دستجات که به طور واضح و مشخص از میکرووسل‏های مجاور، سلول‏های تومور یا دیگر اجزای بافت همبند جدا بودند، به عنوان یک میکرووسل قابل شمارش پذیرفته شدند. مواردی که به نظر می‏رسید از یک رگ مشتق شده‏اند، اگر از آن جدا بودند نیز شمارش شده و محسوب گردیدند. عروق خونی با دیواره عضلانی از مطالعه خارج شدند و میزان متوسط شمارش رگ‏ها در 3 ناحیه به عنوان متوسط دانسیته عروقی (MVD) در هر نمونه ثبت گردید.⁽¹²⁾ در این مطالعه از نرم‏افزار SPSS و آزمون آماریt-test for independent samples  و Fisher exact test جهت مقایسه تراکم عروق خونی و همچنین تراکم ماست‏سل‏های تریپتاز مثبت بین گروه‏ها استفاده شد. در توصیف داده‏ها از جداول توزیع فراوانی و نمودارها استفاده شد و سطح معنی‏داری در این آزمون‏ها 05/0≥P بود.

یافته‏ ها

اطلاعات بالینی مربوط به بیماران به طور خلاصه در جدول 1 مشاهده می‏شود. از لحاظ اطلاعات بالینی اختلاف آماری معنی‏داری بین دو گروه یافت نشد. صددرصد نمونه‏های مورد بررسی در هر دو گروه از نظر رنگ‏آمیزی مارکر‏های CD34 و تریپتاز، مثبت بودند. (تصویر 1و2) میانگین تراکم عروق خونی(MVD) با استفاده از نشانگر CD34 در کیست دنتی‏ژروس 53/0±07/2 و در ادنتوژنیک کراتوسیست 23/1±96/7 بود. (جدول 2) نرمالیتی داده‏ها با استفاده از آزمون کلموگروف – اسمیرنوف ارزیابی شد و مقدار احتمال برای CD34 و تریپتاز به ترتیب 842/0 و 148/0 به دست آمد. آزمون t اختلاف آماری معنی‏داری را بین دو گروه مورد مطالعه نشان داد (004/0P= و 999/1t₍₂₈₎=) به عبارت دیگر MVD در ادنتوژنیک کراتوسیست، به طور معنی‏داری بیشتر از کیست دنتی‏ژروس بود.

میانگین تراکم ماست‏سل‏های تریپتازمثبت در کیست دنتی‏ژروس 35/2±93/3 و در ادنتوژنیک کراتوسیست 37/4±12/12بود. (جدول 3). آزمون t اختلاف آماری معنی‏داری را بین دو گروه مورد مطالعه نشان داد (001/0P< و 386/6t₍₂₈₎=).

ضریب همبستگی Pearson بین مارکرهای CD34 و تریپتاز، در گروه ادنتوژنیک کراتوسیست برابر 420/0- (119/0P=) و در گروه کیست دنتی‏ژروس برابر 135/0- (631/0P=) به دست آمد که در جهت مخالف هم بود ولی این ناهمسو بودن به لحاظ آماری معنی‏دار نبود.

جدول 1 : اطلاعات بالینی مربوط به سن، جنسیت ومکان در گروه‏های تحت مطالعه

تصویر 1 : رنگ‏آمیزی ایمونوهیستوشیمی با استفاده از نشانگر CD34 با بزرگنمایی 400 برابر در A) ادنتوژنیک کراتوسیست

B) در کیست دنتی ژروس

تصویر 2: رنگ‏آمیزی ایمونوهیستوشیمی با استفاده از نشانگر تریپتاز با بزرگنمایی 400 برابر در A) ادنتوژنیک کراتوسیست

B) در کیست دنتی ژروس

جدول 2 : میانگین تراکم عروق خونی با استفاده از نشانگر CD34 در گروه‏های مورد مطالعه

جدول 3 : میانگین تراکم ماست‏سل‏های تریپتاز مثبت در گروه‏های مورد مطالعه

 بحث