مقدمه

شیوع بیماریهای التهابی روده 1(IBD) در سالهای اخیر افزایش چشمگیری داشته است (1,2). شیوع این بیماری ها و         ویژگی های آنها در کشور ما به جمعیت های آسیایی نزدیک است و در بسیاری از موارد با آنچه در کشور های غربی دیده می شود تفاوت دارد (3). از طرفی رفتار بیماری در بیماران ایرانی نیزبا یکدیگر متفاوت می باشد. بر اساس مطالعات قبلی، نقش ژنتیک، اختلال در تنظیم سیستم ایمنی، عوامل لومینال و مسائل محیطی در پاتوژنز این بیماریها اثبات شده است، درپروسه های التهابی مخاط روده، عوامل ایمونولوژیک متعددی دخیل هستند، یکی از این عوامل پروتئین کالپروتکتین است که نقش آن در روندهای التهابی اثبات شده است (4-6). کالپروتکتین مجموعه ای از دو هترودیمر سبک S100A8 و سنگینS100A9  است که در سیتوپلاسم نوتروفیل ها و غشاء مونوسیت ها وجود دارد. به دنبال فعال شدن نوتروفیلها و مونوسیت ها، کالپروتکتین در سرم و مایعات بدن آزاد شده و می تواند به عنوان یک بیومارکر التهاب در بیماریهای التهابی از جمله آرتریت، پریودنتیت، سیستیک فیبروزیس، کلانژیت اسکلروزان و بیماریهای التهابی روده مثل کرون وکولیت اولسراتیو شناخته می شود (7-11).کالپروتکتین پپتیدی با ویژگیهای منحصر بفرد است که از طریق القای تولید نیتریک اکسید (NO) وتحریک ایمنی ذاتی ، کموتاکسی ، تنظیم فعالیت آنزیم NADPH oxidase 2(NOX2) در فاگوسیتوز و اثرات باکتریوستاتیک بر باکتریهایی نظیر اشریشیا کولی3 (E.coli) باعث محدود کردن عوامل مهاجم می شود، ولی از طرفی غلظت بالای آن در محل التهاب در ایجاد عوارض ناشی از التهاب نظیر تخریب بافتی، تولید گونه های فعال اکسیژن (ROS)، آپوپتوز (مرگ برنامه ریزی شده سلول) و تأخیر در ترمیم بافتی نقش دارد (12, 13). بنابراین تظاهرات و رفتار بیماری های التهابی نظیربیماریهای التهابی روده ممکن است با میزان فعالیت وخصوصیات این مدیاتورهای التهابی و تفاوتهای کمی وکیفی در بیان ژنی آنها مرتبط باشد. مطالعات اخیر نیز نشان داده اند که هدف قرار دادن کالپروتکتین به عنوان یک برخورد درمانی جدید می تواند در مهار علایم وعوارض بیماری های التهابی از جمله IBD مؤثر باشد (14, 15). با توجه به تفاوت رفتار بیماریهای التهابی روده در جمعیتهای مختلف و نقش مهم کالپروتکتین در بروز التهاب و عوارض آن، این مطالعه با هدف بررسی فراوانی پلی مورفیسمهای ژنتیکی کالپروتکتین دراین بیماران و ارتباط آن با رفتار بیماریهای التهابی روده در ایران در شهرهای مشهد و ساری انجام شد.

روش کار

با توجه به بیماری مورد مطالعه و عدم انجام مطالعات مشابه، حجم نمونه به صورت در دسترس معادل 170 نفرتعیین شد. بیمارانی وارد مطالعه شدند که مبتلا به کرون یا کولیت اولسرو- اعم از فرم فعال یا غیر فعال بیماری- بوده و تشخیص آنها بر اساس یافته های اندوسکوپیک و بافت شناسی به اثبات رسیده بود. معیار های خروج عبارت بود از: وجود هر گونه بیماری سیستمیک غیر از بیماری التهابی روده. ابتدا پرسشنامه بیماران واجد شرایط با توجه به خصوصیات دموگرافیک و پرونده پزشکی و شرح حال آنها تکمیل شد. متغیرهای مورد مطالعه عبارت بودند از: سن، جنس، نوع بیماری-کرون یا کولیت اولسرو- براساس یافته های بالینی کولونوسکوپی، پاتولوژی و رادیولوژی، مدت زمان بیماری از زمان تشخیص، تعداد عود بیماری در سال، وسعت درگیری روده، عوارض خارج روده ای شامل آرتریت، کلانژیت اسکلروزان اولیه، عوارض چشمی وعوارض پوستی، وجود دیسپلازی و شدت آن، سرطان کولون، رژیم درمانی بیمار و سابقه کولکتومی. سپس cc 2 نمونه خون وریدی بیماران گرفته شد و DNA نمونه خون این افراد به روشsalting out تخلیص شده و سپس با استفاده از پرایمرهای اختصاصی، ناحیه های مورد نظر برای ژن کالپروتکتین تعیین و آلل های مورد نظر (شامل rs3806232C/T از ژن  S100A8و rs3014866 C/T از ژن S100A9) به روشpolymerase chain reaction ( PCR) تکثیر شد.

انجام آزمایشات PCR در مرکز تحقیقات بیوشیمی دانشگاه علوم پزشکی زاهدان انجام شد و نمونه های خونی بیماران شهرهای مشهد و ساری قبل از ارسال در دمای 20- نگهداری شده و طی مدت1 ماه از زمان نمونه گیری جهت تخلیص DNA ارسال شد.

استخراج DNA به روش salting out انجام شد (16). به این منظور 500 میکرولیترخون تام حاوی EDTA، به 800 میکرولیتر بافرشماره 1 شامل 57/1گرمTris HCl ،110گرم ساکارز، 01/1گرم MgCl2 و10میلی لیترتریتون (به منظورهضم غشاءلیپیدی) دریک لیتر محلول آبی به منظور لیزکردن RBC ها اضافه شد. مخلوط فوق در دور g 7000به مدت 2دقیقه سانتریفیوژ شده، محلول رویی را دور ریخته و این عمل یکبار دیگر بمنظور ازبین بردن باقیمانده RBC ها تکرار شد.

مجددا محلول رویی را دور ریخته به باقیمانده که یک رسوب شیری رنگ حاوی گلبولهای سفید خون (WBC) بوده،400میکرولیتر بافرشماره 2 (حاوی57/1گرم Tris HCl و75/3گرم EDTA و60 میکرولیتر 10%SDS دریک لیتر محلول آبی) اضافه ومخلوط به مدت 15 دقیقه دردمای 25تا30درجه سانتیگراد نگهداری شد.

به محلول مرحله قبل 150میکرولیتر محلولNaCl  اشباع و500 میکرولیترکلروفرم اضافه نموده ورتکس کرده ودر دور g 7000 به مدت 2 دقیقه سانتریفیوژشد. محلول رویی را باسمپلر به میکرو تیوب دیگری منتقل کرده و به آن 800 میکرولیتر پروپانول سرد اضافه کرده دردمای 4درجه سانتیگراد به مدت یکساعت قرار داده تا کلاف DNA تشکیل شود. سپس در دور  g 12000 به مدت 2دقیقه سانتریفیوژکرده، به رسوب ،800 میکرولیتر اتانول 70% افزوده ودر دور g12000به مدت 2دقیقه سانتریفیوژتکرار شد. رسوب به دست آمده را به مدت 20دقیقه درانکوباتور 30 درجه سانتیگراد انکوبه کرده تا تمامی الکل تبخیر شود. سپس 100میکرولیتر آب مقطر به رسوب اضافه نموده و به مدت 24ساعت در یخچال نگهداری می کنیم. این  DNAرا می توان دردمای 24- درجه سانتیگراد تا زمان انجام  PCRنگهداری کرد (تمامی مواد ومعرفهای به کار رفته از شرکت  مرک آلمان تهیه شده بودند).

پرایمرهای به کاررفته برای سه جایگاه  واندازه محصولات هریک به شرح زیر می باشد (جدول شماره 1).

برای انجام  PCRبه ازای هرنمونه 8 میکرولیتر آب مقطر و 10میکرولیتر ماستر میکس واز هریک از پرایمرها5/0میکرولیتر افزوده و19میکرولیتر از مخلوط را به میکروتیوب 2/0میلی لیتری منتقل وبه آن1میکرولیتر DNA اضافه کرده و  PCRباشرایط زیرانجام شد.

1-95 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه. 2-95درجه سانتیگراد بمدت 30 ثانیه. 3-59 درجه سانتیگراد به مدت 30 ثانیه. 4-72درجه سانتیگراد به مدت 30 ثانیه. مراحل2 لغایت4 به تعداد 30 سیکل تکراروسپس 72 درجه سانتیگراد به مدت 5 دقیقه ودرانتها، 6-15درجه سانتیگراد بمدت 15ثانیه در دستگاه thermal cycler مدل Bio-Rad Mini قرار داده شد. حال این نمونه جهت الکتروفورز آماده شده است.

نمونه ها را روی ژل آگارز %2 به مدت 30 دقیقه وولتاژ 95 ولت در دستگاه الکتروفورز مدل Labnet300 قرارداده و ژل مربوطه را با دستگاه ژل داک (kimiagene) خوانده وژنوتیپ نمونه ها تعیین شد.

اطلاعات جمع آوری شده با استفاده از نرم افزار SPSS تجزیه و تحلیل شد.  برای مقایسه داده ها از آزمون کای اسکوئر استفاده شد. سطح P کمتر از 05/0 معنی دار در نظر گرفته شد.

نتایج:

از تعداد 170 بیمار مورد مطالعه، 166 نفر شرایط مطلوب را داشته و در مطالعه باقی ماندند و1 نفر به علت ابتلا به لوپوس اریتماتوس، 2نفر مبتلا به دیابت تیپ 1 و 1نفر به علت عدم رضایت به نمونه گیری از مطالعه خارج شدند. 84 مرد و 82 زن وارد مطالعه شدند. میانگین سنی زنان 43 و مردان 45 بود. از این تعداد 132 بیمار کولیت اولسراتیو و34 بیمار کرون داشتند. ژنوتیپ های به دست آمده در شکل شماره 1 و 2 قابل مشاهده می باشد. همانطور که در شکل 1 نشان داده می شود، پپتید تک نوکلئوتیدی rs3014866ژن S100A9 فرمهای هموزیگوت CC،TT و فرم هتروزیگوت CT را نشان می دهد. در حالیکه پپتید تک نوکلئوتیدی rs3806232ژن S100A8 ، ژنوتیپ CC ندارد وژنوتیپ به فرمهای هموزیگوت TT و هتروزیگوت CT دیده می شود (شکل شماره 2). مقایسه توزیع فراوانی ژنوتیپ های مختلف درجدول شماره 2 نشان داده شده است.

شایعترین ژنوتیپِ S100A9 در بیماران مورد مطالعه CT و شایعترین ژنوتیپِ S100A8 در بیماران مورد مطالعه ژنوتیپ TT بود. (P < 0.05) . ارتباط معنی داری بین ژنوتیپ کالپروتکتین و نوع بیماری التهابی روده (کرون-کولیت اولسرو) دیده نشد.  35 نفر(21 %) از بیماران مورد مطالعه تظاهرات خارج روده ای داشتند که آرتریت با 18 نفر، کلانژیت اسکلروزان اولیه با 12 نفر، اریتم ندوزوم با 3 نفر و اسکلریت با 2 نفر شایعترین تظاهرات خارج روده ای بیماران مورد مطالعه بودند. ارتباط معنی داری بین ابتلا به آرتریت وژنوتیپ های S100A8 دیده نشد؛ در حالیکه اکثر بیماران مبتلا به آرتریت دارای ژنوتیپ CC از  S100A9 بودند و ارتباط بین این ژنوتیپ و آرتریت معنی دار بود (05/0>p). شایعترین ژنوتیپ بیماران مبتلا به PSC در ژنهای S100A8 و S100A9 به ترتیب TT و CT بود ولی اختلاف معنی داری بین ابتلا به PSC و ژنوتیپ کالپروتکتین مشاهده نشد. همچنین اختلاف بین شیوع سایرتظاهرات خارج روده ای بیماران شامل تظاهرات پوستی و چشمی وژنوتیپهای مورد مطالعه معنی دار نبود. در 120 بیمار مورد مطالعه برای کنترل بیماری ، درمانهای خط دوم شامل استروئیدها و آزاتیوپرین تجویز شده است که 102 نفر (85 %) دارای ژنوتیپ TT ژن S100A8 بودند و این ژنوتیپ ارتباط معنی داری با این گروه از بیماران داشت(05/0>p)، ولی آنالیز داده ها ارتباط معنی داری بین این بیماران و ژنوتیپ های S100A9 نشان نداد (05/0<p). در 16  بیمار از بیماران مورد بررسی داروهای خط سوم ( اینفلیکسیماب یا سیکلوسپورین ) جهت کنترل بیماری تجویز شده بود، ولی استفاده از این داروها ارتباط معنی داری با  ژنوتیپهای مورد مطالعه کالپروتکتین نداشت.2 بیمار مورد مطالعه بعلت دیسپلازی و 1 بیمار با تشخیص کانسر کولون کولکتومی شده بودند که همگی ژنوتیپ TT ژن S100A8 و CT ژن S100A9 داشتند، ولی ارتباط معنی داری با این ژنوتیپها دیده نشد. در بررسیها گرچه ارتباط معنی داری بین بیماران با 1 و 2 بارحملات بیماری در سال و ژنوتیپ کالپروتکتین دیده نشد ، در 10 بیمارکه در سال گذشته حداقل 3 بارعود بیماری داشته اند، ژنوتیپ CC ژن S100A9 بطور معنی داری شایعتر از سایر ژنوتیپها بود (05/0>p) (جدول شماره 3). بیماران کرون که درگیری پری آنال داشتند، ژنوتیپ CT ژن S100A9 و ژنوتیپ TT ژن S100A8 داشند، ولی اختلاف معنی دار نبود (7/0>p) و بطور کلی وسعت درگیری روده در بیماری کرون و کولیت اولسرو با ژنوتیپهای کالپروتکتین بی ارتباط بود (جدول شماره 4).

بحث

کالپروتکتین پپتیدی با ویژگیهای منحصر بفرد است وبه عنوان بیو مارکر و بازیگر اصلی فرایندهای پاتوفیزیولوژیک در بیماریهای التهابی از جمله بیماریهای التهابی روده مثل کولیت اولسراتیو و کرون شناخته می شود (8). کالپروتکتین با افزایش تولید کموکینهای التهابی خاص وافزایش بیان مولکولهای چسبنده پاسخ التهابی را تحریک می کند (5).

افزایش پروتئین کالپروتکتین در مدفوع بیماران به عنوان یک بیومارکرمفید در شناخت وضعیت بیماران التهابی روده شامل کرون و کولیت اولسراتیو شناخته می شود (17).

در مطالعه  Leachو همکاران، افزایش بیان ژنهای S100A8و S100A9، بر اطفال مبتلا به بیماریهای التهابی روده در موکوس رکتال و سرم گزارش شده است (18). در مطالعه ای بر روی سگها، غلظت کالپروتکتین سرم هم به عنوان یک بیومارکر مناسب برای تشخیص التهاب در بیماری IBD معرفی شد ولی این افزایش غلظت با ضریب فعالیت بیماری، غلظت پروتئین C راکتیو و شدت تغییرات پاتولوژیکی ارتباط نداشت (19). در مطالعه دیگری بر بیماران کرون، کالپروتکتین سرم در فرم فعال بیماری بسیار بیشتر از فرم غیر فعال بوده و غلظت سرمی آن با غلظت پروتئین C راکتیو و اندکس فعالیت بیماری ارتباط مستقیم داشته است (20).

در این مطالعه فراوانی ژنوتیپ های کالپروتکتین را در بیماران کولیت اولسراتیو و یا کرون بررسی شد و ارتباط آن به طور کیفی با رفتارهای مختلف بیماری (حملات بیماری، عوارض خارج روده ای ، نیاز به داروهای خط اول و دوم ، نیاز به کولکتومی وکانسر کولون) مقایسه شد.

در مطالعه تروسکایا1 و همکارانش درسال 2008 اثبات شد که کالپروتکتین نقش اساسی را درtumor-stromal interactions دارد که منجر به  ایجاد سرطان کولون در زمینه کولیت می شود (21). در مطالعه حاضر فقط یک نفر مبتلا به سرطان کولون بود که در بررسی های آماری ارتباط معنی داری با ژنوتیپهای کالپروتکتین مشاهده نشد.

تاکنون مطالعات بسیار کمی درمورد بررسی ارتباط واریاسیونهای ژنی کالپروتکتین وبیماریهای مختلف انجام شده است.

در سال 2007، لی2 و همکاران با بررسی بر 321 نفر شامل بیماران پریودونتیت مزمن، پریودونتیت مهاجم و گروه کنترل سالم نشان دادند که ارتباط محکمی بین پلی مورفیسم ژنی کالپروتکتین و ابتلا به پریودونتیت در بیماران چینی وجود دارد (22).

در مطالعه دیگری که در سال 2009 توسط رن3 و همکاران بر 204 نفر از 73 خانواده انجام شد. تجزیه و تحلیل داده ها ضمن تایید مطالعه قبلی نشان داد که پلی مورفیسم تک نوکلیوتیدی rs3795391 با استعداد (susceptibility) بیشتر ابتلا به پریودونتیت مهاجم همراه است (23).

سان4 و همکاران نیز در مطالعه ای نشان دادندکه پلی مورفیسم کالپروتکتین در استعداد ابتلا به بیماری و شدت آن نقش دارد. غلظت کالپروتکتین سرم در بیماران با پریودونتیت شدید بیشتر از کنترل بود و گزارش شد ژنوتیپ AA از ژنS100A8(rs 3795391)  در بیماران بیشتر از افراد سالم بود در حالیکه فراوانی آلل G در بیماران نسبت به کنترل کاهش نشان داد (24).

مطالعه حاضر نشان داد که شایعترین ژنوتیپ کالپروتکتین در بیماری های التهابی روده ژنوتیپ TT ژن S100A8 و ژنوتیپ CT ژن S100A9 می باشد، ولی با توجه به نداشتن گروه کنترل در مطالعه حاضر، نمی توان در مورد تاٌثیر این پلی مورفیسم ژنی در ایجاد بیماری التهابی روده قضاوت کرد.

این مطالعه نشان داد که در مجموع تفاوت معنی داری در عوارض خارج روده ای بیماری براساس پلی مورفیسم ژنتیکی کالپروتکتین وجود ندارد. اما شایعترین عارضه خارج روده ای بیماری یعنی آرتریت ( که در مطالعه حاضر نیز بیش از 50 % عوارض خارج روده ای را شامل می شد)  به طور معنی داری با ژنوتیپ CC ژن S100A9 مرتبط است و بیماران مبتلا به IBD با این ژنوتیپ استعداد بیشتری از نظر ابتلا به آرتریت نشان دادند، در حالی که این عارضه با ژنوتیپهای S100A8 بی ارتباط بود.

همچنین در بیمارانی که به بیماری متوسط تا شدید مبتلا بودند و جهت کنترل بیماری به داروهای خط دوم (کورتیکواستروئیدها، آزاتیوپرین و 6-مرکاپتوپورین) نیاز داشتند، شایعترین ژنوتیپ ژن S100A8، TT بود و ارتباط معنی داری بین این ژنوتیپ و مصرف داروها وجود داشت ؛ بنابراین بر اساس مطالعه حاضر به نظر می رسد بیمارانی که این ژنوتیپ را دارا هستند، استعداد بیشتری برای ابتلا به نوع متوسط تا شدید بیماری دارند.از طرفی تمام بیمارانی که ژنوتیپ CC ژن S100A9 داشتند از داروهای خط دوم استفاده می کردند، ولی این ارتباط معنی دار نبود (08/0=p). البته با توجه به p به دست آمده این نتیجه می تواند ناشی از محدودیت طرح ما و کم بودن حجم نمونه باشد.

از طرف دیگر ارتباط معنی داری بین بیمارانی که به داروهای خط سوم (نظیر اینفلیکسیماب و سیکلوسپورین) نیاز داشتند و ژنوتیپهای مورد مطالعه مشاهده نشد که با توجه به اینکه این دسته از بیماران کمتر از 10 % بیماران مورد بررسی را تشکیل می دادند، افزایش حجم نمونه در مطالعات آینده می تواند برای رسیدن به نتیجه دقیقترکمک کننده باشد. در مطالعه حاضر ژنوتیپ CC ژن S100A9 ارتباط معنی داری با بیش از 3 حمله بیماری در سال داشت ، ولی در بیماران با کمتر از 3 بار عود در سال ارتباط معنی داری بین حملات و پلی مورفیسم ژنی کالپروتکتین دیده نشد. این مطالعه ارتباطی بین بیماریهای پری آنال ناشی از IBD و پلی مورفیسم مورد بررسی نشان نداد.

با توجه به نداشتن گروه کنترل در این مطالعه، اگرچه نمی توان در مورد نقش پلی مورفیسم کالپروتکتین در ایجاد بیماری التهابی روده اظهار نظر کرد، ولی نتایج نشان داد که پلی مورفیسم ژنتیکی کالپروتکتین در برخی رفتار های بیماریهای التهابی روده تاثیر گذار است، چنانکه بیماران دارای ژنوتیپ CC ژنS100A9  بیشتر به آرتریت (به عنوان عارضه خارج روده ای بیماری) مبتلا بودند وعود های مکرر(بیش از سه بار عود در سال) در آنها شایعتر بود، درحالیکه بیماری متوسط تا شدید (که جهت کنترل بیماری نیاز به شروع داروهایی نظیر آزاتیوپورین و پردنیزولون داشت) شیوع بیشتری در بیماران با ژنوتیپ TT ژن S100A8 داشت، که تاکیدی است براین فرضیه که پلی مورفیسم کالپروتکتین می تواند در ایجاد تظاهرات و رفتار بیماریهای التهابی نقش داشته باشد.

نتیجه گیری

مطالعه حاضر نشان داد که پلی مورفیسم ژنتیکی کالپروتکتین می تواند در برخی رفتار های بیماریهای التهابی روده تاثیر گذار باشد. تا کنون مطالعه دیگری در مورد نقش پلی مورفیسم ژنتیکی کالپروتکتین در بیماریهای التهابی روده انجام نشده است و مطالعه حاضر اولین بررسی در مورد ارتباط آن با بیماریهای التهابی روده است. مطالعات بیشتری لازم است که اولا نقش ژنوتیپهای کالپروتکتین را در بروز بیماریهای التهابی روده نشان دهد و از طرف دیگر ارتباط آن را با شدت فعالیت بیماری و سایرویژگیهای بیماری مورد بررسی قرار دهد.