مقدمه

لیکن پلان یک بیماری ایمونولوژیک مزمن پوستی مخاطی باطیف وسیعی از تظاهرات بالینی می باشد. در این بیماری، مخاط دهان معمولاً درگیر بوده و ممکن است تنها محل درگیری باشد. لیکن پلان دهانی یک تا دو درصد از جمعیت بزرگسالان را تحت تاثیر قرار می دهد و شایعترین بیماری غیرعفونی مخاط دهان است. این بیماری زنان را 4/1 بیشتر از مردان تحت تأثیر قرار می دهد و عمدتاً در بزرگسالان بالای 40 سال رخ میدهد.⁽¹⁾

لیکن پلان دارای انواع مختلفی بوده که شایعترین آن رتیکولر و انواع زخمی و اروزیو است که این نوع آخر می تواند بیشتر چالش برانگیز باشد و به احتمال بیشتری ممکن است  به سمت ضایعات دیس پلاستیک پیشرفت نماید.^(2،3)

کاندیدا آلبیکانس، شایعترین پاتوژن قارچی درانسان است. کاندیدا آلبیکانس و تا حدودی دیگر گونه های کاندیدا درحفره دهان، تا 75 درصد جمعیت مردم وجود دارند.⁽⁴⁾ در افراد سالم این کلونیزاسیون، عموماً خوش خیم باقی می‌ماند. با این حال، افراد دارای نقص ایمنی خفیف، اغلب ممکن است از عفونت های فرصت طلب حفره دهان رنج ببرند.^(6،5)

لیکن پلان از نظر بافت ‌شناسی گه گاه  دارای هیپرکراتینیزاسیون بوده که احتمالا ً استعداد عفونت کاندیدیایی را افزایش خواهد داد. اما نواحی اریتماتوز در لیکن پلان دهانی با سوپرایمپوز شدن عفونت کاندیدیائی با عوارضی مانند درد و سوزش همراه است. بنابراین شناسایی و حذف این عوامل قارچی می تواند در کمک به کاهش درد و سوزش بیماران موثر باشد.⁽⁷⁾ برای تشخیص عفونت کاندیدا رنگ آمیزی های مختلف از جمله هیدروکسیدپتاسیم، کشت قارچ،(GMS) Gomori's methenamin sliver ، Periodic Acid-Shift (PAS) و ... وجود دارد. با توجه به مقالات متعدد هیدروکسید پتاسیم و کشت قارچ زمان بر بوده و حساسیت کمی برای تشخیص خواهند داشت. چنانچه Kermanshahi و همکاران⁽⁸⁾، بیان داشته اند که PAS حساسیت بیشتری برای تشخیص عفونت کاندیدا دارد  و موارد منفی کاذب کمتری دارد. اما در مطالعه ای که توسط D'Huz و همکاران⁽⁹⁾، روی انکومایکوز انجام گرفت بیان شد که رنگ آمیزی Gomori's  در تشخیص کاندیدا آلبیکانس نسبت به رنگ آمیزی PAS حساسیت بیشتر و کیفیت بهتری دارد.

واکنش دوره ای اسید شیف (PAS)، یک تکنیک رنگ آمیزی است که حضور گلیکوژن، پلی ساکارید و موسین را در بافت شناسایی می کند و هسته قارچ به رنگ  صورتی تیره یا سرخابی مشاهده می شود. اما در رنگ آمیزی (GMS)، دیواره سلولی این موجودات به رنگ قهوه ای مایل به سیاه مشخص می شود. قارچ ها و باکتری ها به رنگ سیاه و موکوپلی ساکارید خاکستری تیره و بافت زمینه سبز کم رنگ می گردد.⁽¹⁰⁾ Kawilareng و همکاران⁽¹¹⁾، با مقایسه دو رنگ آمیزی  PAS و GMS روی 4  نوع قارچ به این نتیجه رسیدند که رنگ آمیزی GMSدقیقتر از رنگ آمیزی PAS است. نتایج رنگ‌آمیزیPAS  برای تشخیص قارچ در این مطالعه 60 درصد و کاملاً واضح بود اما در رنگ آمیزیGMS، نتایج 100 درصد بسیار واضح بود.

با توجه به اینکه مطالعات زیادی در خصوص قدرت تشخیصی این دو رنگ‌‌ آمیزی و حساسیت و اختصاصیت آنها انجام نشده است و در این مورد توافق نظری وجود ندارد، لذا  مطالعه حاضر با هدف بررسی مقایسه ای تشخیص قارچ کاندیدا آلبیکانس در لیکن پلان دهانی اروزیو با رنگ آمیزی GMS و PAS طراحی شد.

مواد و روش ها

مطالعه ی حاضر از نوع توصیفی-تحلیلی مقطعی بود. جامعه مورد بررسی نمونه های با تشخیص لیکن پلان اروزیو موجود در آرشیو بخش آسیب شناسی دهان دانشکده دندانپزشکی اصفهان بود. پس از  استخراج نمونه ها از آرشیو، اطلاعاتی از جمله محل و نمای بالینی ضایعه، سن و جنس بیماران از پرونده ها بدست آمده و در چک لیستی ثبت شد.

پس از ارزیابی لام هایH&E  نمونه ها و تائید تشخیص توسط 3 پاتولوژیست دهان، لام­ها با دو روش GMS و PAS  مورد رنگ آمیزی قرار گرفت. روش رنگ آمیزی PAS یک تکنیک هیستوشیمیایی برای رنگ آمیزی کربوهیدرات هاست و براساس اسید اکسیداسیون دوره ای یک ماده حاوی گروه های هیدروکسیل است. روش رنگ آمیزی GMS نیز مبتنی بر اکسیداسیون اسیدی دیواره های سلولی قارچ به گروه های آلدهیدی است و اسید کرومیک پلی ساکاریدهای دیواره سلولی قارچ ها را به آلدهید اکسید میکند و متنامین سیلور نیترات را به نقره متالیک تبدیل میکند.^(10،11) سپس سه پاتولوژیست دهان و فک و صورت  بصورت همزمان اسپور و هیفاهای قارچ در کل برش های دو نوع رنگ آمیزی را توسط میکروسکوپ(Olympus, Japan)با بزرگنمایی 400 شمارش کردند و حضور کاندیدا به شکل زیر گروه بندی شد. گروه 1: بدون حضور قارچ، گروه 2: تنها به شکل اسپور(هاگ). گروه3 : تعداد کمی اسپور(هاگ) و هایفا ،گروه4 : تعداد زیادی اسپور(هاگ) و هایفا⁽²⁾. تجزیه و تحلیل آماری توسط آزمون های توصیفی و تحلیلی، رگرسیون خطی و آزمون دقیق فیشر و همچنین آزمون کای اسکوئر جهت مقایسه انجام شد. سطح معنی داری 05/0 بود.

یافته ها

مطالعه حاضر با هدف بررسی مقایسه ای تشخیص کاندیدا در لیکن پلان دهانی اروزیو با رنگ آمیزی  GMS و PAS انجام شد و تعداد 30 پرونده بیمار مبتلا به لیکن پلان دهانی اروزیو مورد بررسی قرار گرفت. از 30 پرونده مورد بررسی، 25 پرونده (3/83 درصد) زن و 5 پرونده (7/16درصد) مرد و 17 نفر( 7/56 درصد) افراد مورد مطالعه کمتر از 46 سال و 13 نفر ( 3/43 درصد) بالای 46 سال سن داشتند. اکثر موارد ضایعه لیکن پلان دهانی اروزیو در گونه با 14 مورد (7/46 درصد) و کمترین میزان بروز در زبان وکام با 2 مورد (7/6 درصد) مشاهده شد. روش رنگ آمیزی PAS در 14 مورد(7/46 درصد) موارد عدم وجود هاگ و هایفا، در 9 مورد(30 درصد) فقط هاگ و در 7 نمونه(3/23 درصد) تعداد کمی هاگ و هایفا مشاهده شد. اشکال 1و2 حضور هاگ و هایفا را بارنگ آمیزی PAS نشان میدهد. روش رنگ آمیزی GMS در16 مورد(3/53 درصد) عدم وجود هاگ و هایفا، در 6 نمونه(20 درصد) فقط هاگ و در 8 مورد(7/26 درصد) تعداد کمی هاگ و هایفا را نشان داد. اشکال 3 و4 حضور هاگ و هایفا را با رنگ آمیزی GMS نشان میدهند. در هیچکدام از نمونه ها در دو روش رنگ آمیزی، گروه4 مطالعه، یعنی تعداد زیاد اسپور و هایفا، دیده نشد.

فراوانی کاندیدیازیس در لیکن پلان دهانی اروزیو با هر دو نوع رنگ آمیزی GMS و PAS براساس جنس ، محل ضایعه و سن بیماران با استفاده از آزمون دقیق فیشر اختلاف معناداری نشان نداد.(05/0<p)

براساس جدول 1، که به بررسی تطابق بین دو روش رنگ آمیزی می پردازد، از تعداد کل 14 مورد که در روش رنگ آمیزی PAS هیچ شواهدی از هاگ و هایفا مشاهده نشد. با روش رنگ آمیزی GMS تعداد 2 مورد(66/6 درصد) فقط هاگ و 2 مورد(66/6 درصد)  تعداد کمی هاگ و هایفا مشاهده شد و در 10 مورد(33/33 درصد) در دو روش رنگ آمیزی هاگ و هایفا مشاهده نشد. از تعداد کل 9 مورد در روش رنگ آمیزی PAS  که تنها هاگ مشاهده شد، با روش رنگ آمیزی GMS تعداد 5 مورد(67/16درصد)  هاگ و هایفا مشاهده نشد و 2مورد (66/6 درصد)  تعداد کمی هاگ و هایفا مشاهده شد و تنها 2 مورد ( 66/6درصد)  در دو روش رنگ آمیزی فقط هاگ قابل مشاهده بود. از تعداد کل 7 مورد در روش رنگ آمیزی PAS که تعداد کمی هاگ و هایفا مشاهده شد، با روش رنگ آمیزی GMS تعداد 1 مورد (36/3درصد)  هاگ و هایفا مشاهده نشد و 2مورد (66/6درصد)   فقط هاگ و در 4 مورد(33/13 درصد)   در دو روش رنگ آمیزی تعداد کمی هاگ و هایفا مشاهده شد.

جدول 1. بررسی تطابق بین دو روش رنگ آمیزی PAS و  GMS در گروه بندی های مختلف حضور کاندیدا ( آزمون کای اسکوئر)

بحث

لیکن پلان یک بیماری التهابی مزمن و شایع پوستی مخاطی است که در رابطه با پتانسیل بدخیمی آن اختلاف نظر وجود دارد. سازمان بهداشت جهانی آن را به عنوان یک ضایعه پیش سرطانی بالقوه تعریف کرده است.⁽²⁾ میزان تغییر بدخیمی آن کم است و معادل 5 درصد از موارد در نظر گرفته می شود.⁽³⁾ هرچند برخی مطالعات از جمله مطالعه Khadem و همکاران⁽¹³⁾، احتمال تغییرات دیسپلازی در ضایعات لیکن پلان را به خصوص در نواحی مانند مخاط باکال زبان و بوردر زبان گوشزد می کنند. در مطالعه ای که توسط Hebbar و همکاران⁽¹⁴⁾، انجام شد، حضور کاندیدا در ضایعات مخاطی دهان با استفاده از رنگ آمیزی PAS بررسی شد. نتایج آنها از نقش قارچ در روند ایجاد تغییرات سلولی در بافت اپی تلیال حمایت کرد، هرچندکه همچنان بیان کردند شیوع کاندیدا در این ضایعات می تواند تصادفی بوده و به فاکتورهای محیطی متغییرکه تکثیرقارچ ها را سبب میشود ارتباط داشته باشد. ولی نکته قابل توجه در این مطالعه عدم مقایسه روش PAS  با روش های رنگ آمیزی دیگر بود. با در نظر گرفتن اهمیت شناسایی حضور کاندیدا در پیدایش بدخیمی در لیکن پلان دهانی و درمان این بیماری، روش های مختلفی به منظور شناسائی حضور کاندیدا  انجام شده است. چنانچه بر اساس معیارهای استفاده شده توسط انجمن آسیب شناسی پوست آمریکا (AUC) هر دو روش رنگ آمیزی GMS و PAS قابلیت اطمینان و قدرت تشخیصی بالایی دارند. اما لازم به ذکر است براساس جستجوهای انجام شده مطالعات مشابه قابل توجهی که به بررسی دو روش رنگ آمیزی مذکور در تشخیص لیکن پلان اروزیو پرداخته باشد، مشاهده نشد و در معدود مطالعات به بررسی دو روش رنگ آمیزی مذکور در بیماری های دیگر پرداخته بودند.⁽⁸⁾ لذا با توجه به کمبود مطالعات انجام شده در خصوص مقایسه دو روش رنگ آمیزی مذکور در تشخیص کاندیدا در لیکن پلان دهانی اروزیو ، امکان چندانی برای مقایسه نتایج مطالعات حاضر با سایر مطالعات وجود ندارد و این موضوع جزء محدودیت های مطالعه حاضر میباشد.  از این رو مطالعه حاضر با هدف بررسی مقایسه ای تشخیص کاندیدا در لیکن پلان دهانی اروزیو با رنگ آمیزی GMS و PAS بر روی 30 پرونده بیمار مبتلا به لیکن پلان دهانی اروزیو (25پرونده (3/83 درصد) زن و 5 پرونده (7/16درصد) مرد) انجام شد. 7/56 درصد افراد مورد مطالعه کمتر از 46 سال و 3/43 درصد بالای 46 سال سن داشتند. اکثر ضایعه لیکن پلان دهانی اروزیو در گونه (7/46 درصد) و کمترین میزان بروز در زبان وکام (7/6 درصد) مشاهده شد. در روش رنگ آمیزی PAS در 7/46درصد موارد عدم وجود هاگ و هایفا، 0/30 درصد فقط هاگ و3/23 درصد تعداد کمی هاگ و هایفا مشاهده شد. در روش رنگ آمیزی GMS در 3/53 درصد موارد عدم وجود هاگ و هایفا، 20 درصد فقط هاگ و 7/26 درصد تعداد کمی هاگ و هایفا مشاهده شد. براساس نتایج مطالعه حاضر، تفاوت معناداری میان سن ، جنس و محل بروز ضایعه در بیماران مورد بررسی در دو روش رنگ آمیزی GMS و PAS وجود نداشت.

در خصوص ارتباط بین دو روش رنگ آمیزی در مطالعه حاضر، روش رنگ آمیزی PAS تعداد بیشتری ازهاگ وهایفای کاندیدا را نسبت به روش رنگ آمیزی GMS نشان داد. اما Kermanshahi و همکاران⁽⁸⁾، در مطالعه خود که حساسیت رنگ امیزی GMS و PAS در عفونت انکومایکوزیز را مورد بررسی قرار دادند، بیان نمودند که تفاوت معنا داری در برتری این دو روش رنگ آمیزی نسبت به هم در تشخیص وجود ندارد، که شاید این اختلاف به دلیل تفاوت در نوع بیماری مورد بررسی در این مطالعه باشد.در مطالعه ای که توسط Padilha و همکاران⁽¹⁵⁾ انجام شد، دو روش رنگ آمیزی PAS و پاپانیکولائو (Pap) را در تشخیص کاندیدا در مخاط دهان مورد بررسی قرار دادند و بیان نمودند  که روش رنگ آمیزی PAS روش مناسبی برای تشخیص گونه های دهانی کاندیدا است. با وجود تفاوت در روش های رنگ آمیزی مطالعه حاضر با مطالعه Padilha و همکاران⁽¹⁵⁾، به دلیل برتری روش رنگ آمیزی PAS، می توان نتایج دو مطالعه را هم راستا با هم بیان نمود.Bhovi  وهمکاران⁽¹⁶⁾، نیز در مطالعه خود عفونت قارچی در بیوپسی ضایعات مخاطی دهان را با استفاده از روش رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین و روش PAS مورد بررسی قرار دادند و قدرت تشخیصی روش رنگ آمیزی PAS را موثر تر از هماتوکسیلین و ائوزین بیان نمودند. در این مطالعه، از لحاظ آماری ارتباط معناداری بین عفونت قارچی در ضایعات دیسپلاستیک با مکان ضایعات در زبان و مخاط باکال مشاهده شد. بنابراین آنها نتیجه گیری کردند که هر زمان که دیسپلازی اپیتلیال در زبان و مخاط باکال تشخیص داده شد، بهتر است رنگ آمیزیPAS نیز انجام شود. از این رو نتایج مطالعه حاضر با مطالعه Bhovi  وهمکاران⁽¹⁶⁾، هم راستا می باشد.

در تایید نتایج مطالعه حاضر می توان به مطالعه  Sarkateو همکاران⁽⁵⁾، نیز اشاره نمود که بیان کردند دیواره های سلولی قارچ از پلی ساکاریدها تشکیل شده اند، که پس از اکسیداسیون، گروه های آلدئیدی را تشکیل می دهند، که امکان شناسایی آن ها با استفاده از روش های رنگ آمیزی GMS یا PAS فراهم میگردد. در رنگ آمیزی GMS قارچ های دژنره شده و غیر قابل دسترس ، با کنتراست بهتری مشخص میشوند. اما این روش رنگ آمیزی وابسته به زمان و دما بوده و چالش های استفاده از تکنیک  پیچیده تر، نیاز به مهارت های بالای تکنسین دارد تا به دشواری های مرتبط با اجرا کردن این رنگ آمیزی غلبه کند. واکنش GMS متکی به اکسیداسیون دیواره های سلولی پلی ساکارید توسط کرومیک اسید و به دنبال آن اتصال یون های نقره به گروه های آلدئیدی تازه ظاهر شده دیواره سلولی قارچ است. و با کاهش نقره و تبدیل  به شکل فلزی آن قابل مشاهده می شود. رنگ آمیزیGMS با رنگ‌آمیزی سیاه دیواره سلولی قارچ، معمولاً در برابر رنگ سبز روشن زمینه تشخیص داده می‌شود. GMS می تواند ارگانیسم های غیر زنده و همچنین زنده را رنگ آمیزی کند. همچنین مزیت رنگ‌آمیزی پس‌زمینه کم را در صورت اجرای مناسب دارد و می‌تواند برخی از پاتوژن‌های عفونی غیر قارچی را نیز رنگ‌آمیزی کند، و از این نظر نسبت به روش رنگ آمیزی PAS از حساسیت تکنیکی بالاتری برخوردار است. اما احتمال اینکه منفی کاذب بالاتری داشته باشد، بیشتر است.در رنگ آمیزی PAS، دیواره‌های سلولی قارچ و گروه‌های آلدهید حاصل با معرف شیف واکنش نشان می‌دهند تا به عنوان رنگ سرخابی روشن مشاهده شوند. از آنجایی که اسید پریودیک یک اکسید کننده ضعیف در نظر گرفته می شود، عناصر بافتی با مقادیر کم پلی ساکارید (مانند غشای پایه، رشته های فیبرینوئید و برخی از انواع کلاژن) نیز با این واکنش قابل مشاهده خواهند بود، در حالی که اسید کرومیک قوی برای اکسیداسیون در روش GMS ، باعث اکسیداسیون در مرحله آلدهید و عدم تجسم این ساختارها در شرایط عادی می شود. افزودن دیاستاز به واکنش PAS می‌تواند برخی از رنگ‌آمیزی‌های پس‌زمینه را حذف کند. همچنین از مشکلات رنگ آمیزی در روش PAS در مقایسه با رنگ آمیزی GMS این است که ممکن است تمام گونه های قارچی را به خوبی نمایان نکند و عوامل غیر زنده معمولاً به خوبی رنگ آمیزی نمی شوند.⁽⁵⁾

براساس نتیجه حاصل از این مطالعه، به صورت کلی می توان بیان نمود که بدون در نظر گرفتن شرایط سنی بیماران، جنس و محل بروز ضایعه استفاده از روش رنگ آمیزی PAS قدرت تشخیصی بیشتری در نشان دادن کاندیدا در ضایعات لیکن پلان اروزیو دهانی دارد ولی بایستی به منظور تصمیم گیری قطعی در این خصوص لازم است که مطالعات بیشتری در زمینه بررسی و مقایسه دو روش رنگ آمیزی PAS و GMS در تشخیص حضور کاندیدا در لیکن پلان اروزیو دهانی انجام شود.

به دلیل کمبود منابع اطلاعاتی در خصوص مقایسه قدرت تشخیص رنگ آمیزی های بکار رفته در تشخیص کاندیدا در لیکن پلان دهانی اروزیو، پیشنهاد می شود مطالعات بیشتری در این خصوص انجام شود.

نتیجه گیری

قدرت تشخیص کاندیدیازیس در لیکن پلان دهانی اروزیو با رنگ آمیزی PAS به مراتب بیشتر از روش رنگ آمیزی GMS است و سن، جنس و محل ضایعه در قدرت و حساسیت این روشهای رنگ آمیزی موثر نیست.

تشکر و قدردانی

این مقاله بخشی از پایان نامه دکترای دندانپزشکی با کد تحقیقاتی 3402422 و کد اخلاق IR.MUI.DHMT.REC.1402.010 میباشد که معاونت پژوهشی و دانشکده دندانپزشکی دانشگاه علوم پزشکی اصفهان از آن پشتیبانی کرده است. نویسندگان همچنین از آزمایشگاه دکتر برادران بابت همکاری در رنگ آمیزی
لام ها نیز سپاسگزار است.

تضاد منافع

هیچگونه تعارض منافعی وجود ندارد.