مقدمه

بیش از 90 درصد سرطان‌‌های حفره دهان را کارسینوم سلول سنگفرشی دهان(Oral squamous cell carcinoma/OSCC) تشکیل می‌‌دهد که از اپی‌‌تلیوم حفره دهان به وجود می‌‌آید و از نظر بیولوژی سرطانی هتروژنوس است. اغلب ضایعات تا مراحل پیشرفته ممکن است تشخیص داده نشوند که عاملی برای پایین بودن میزان بقای بیماران می‌‌باشد؛ بنابراین تشخیص به موقع و زود هنگام این ضایعات اهمیت زیادی دارد.⁽¹⁾ OSCC می‌تواند از ضایعات پیش سرطانی یا با پتانسیل تبدیل به بدخیمی (Potentially Malignant Oral Lesions/PMOL) که در مقایسه با مخاط سالم در معرض افزایش ریسک تبدیل به بدخیمی هستند، ایجاد شود. لکوپلاکیا ازشایع‌‌ترین ضایعات پیش‌‌سرطانی می‌باشد.^(3و2) وجود دیسپلازی اپی‌‌تلیال در ضایعات پیش سرطانی به عنوان یکی از مهمترین پیش‌‌بینی کننده‌‌های پیشرفت بدخیمی پذیرفته شده است. عدم اطمینان در مورد اینکه آیا همه ضایعاتی که به عنوان پیش‌‌بدخیم مشخص می‌‌شوند، در نهایت به سرطان تبدیل می‌‌شوند یا خیر، وجود دارد. بسیاری از تحقیقات می‌‌کوشند تا با استفاده از نشانگرهای زیستی‌‌مولکولی که در پیدایش سرطان‌ها نقش دارند، عدم قطعیت‌‌ در تشخیص ریسک تبدیل به بدخیمی را کاهش دهند.⁽⁴⁾

گیرنده فاکتور رشد اپیدرمال (Epidermal Growth Factor Receptor/EGFR) تعدادی مولکول سیگنالینگ پایین دست را فعال می‌‌کند، که منجر به فعال شدن چندین مسیر مهم برای رشد تومور، پیشرفت و بقای آن
می‌‌شود.^(7-5) بیان بیش از حد EGFR در تومورهای متعدد شناسایی شده است. سرطان‌‌های مرتبط شامل سرطان‌‌های پستان، سر و گردن، سلول‌‌های کوچک ریه و سلول سنگفرشی ریه،  کلیوی، تخمدان، روده بزرگ، مثانه و ... است. تحقیقات مرتبط با EGFR منجر به شناخت روش‌‌های درمانی جدیدی از جمله آنتی‌‌بادی‌‌های مونوکلونال طراحی شده برای مهار سیگنالینگ EGFR می‌‌شود.⁽⁸⁾

لذا در مطالعه حاضر جهت بررسی پیشرفت ضایعات به سمت بدخیمی و بروز کارسینوم‌‌، بیان EGFR را درلکوپلاکیای دهانی دیسپلاستیک و غیردیسپلاستیک و مخاط  نرمال دهان مورد مقایسه و ارزیابی قرار دادیم.

مواد و روش ها

در این بررسی تعداد 45 نمونه مربوط به لکوپلاکیای دهانی با و بدون دیسپلازی و بافت نرمال بدون التهاب (نمونه‌‌های بیوپسی شده از ضایعات فیبرواپیتلیال هایپرپلازی یا فیبروما‌‌ی دهان) از آرشیو ‌‌بخش آسیب‌شناسی دانشکده دندانپزشکی مشهد، انتخاب شد. (هر گروه
 15 نمونه) بلوک‌های پارافینی نمونه‌های مورد مطالعه پس از بازبینی توسط پاتولوژیست‏های طرح و نشانه‌گذاری کانون مناسب در لام از آرشیو گرفته شد. این بلوک‌ها دارای بیشترین حجم بافتی و مناسب جهت انجام تکنیک‌های ایمونوهیستوشیمی بودند. نمونه‌های کنترل منفی شامل نمونه‌های مورد مطالعه بودند که آنتی‏بادی اولیه در طی کار روی آنها استفاده نگردید. پس از بررسی مورفولوژیک  توسط دو نفر از اساتید ‌بخش پاتولوژی از هر بلوک پارافینی 2 برش بافتی به ضخامت 5-4 میکرون تهیه شد. برش‌‌های مذکور از نظرکمیت و کیفیت کانون‌‌های تشخیصی  تأیید‌ شده، نمونه‌‌ها براساس واکنش آنتی ژن-آنتی بادی توسط نشانگر EGFR(NCL-L-EGFR, Novacastra laboratories, Newcastle UK dilution 1: 20, clone EGFR113)   با استفاده از روش ارائه شده توسط شرکت سازنده کیت رنگ‌‌آمیزی شدند و لام‌‌های رنگ‌‌آمیزی شده توسط پاتولوژیست‌‌های مجری بوسیله میکروسکوپ نوری مورد مطالعه قرارگرفتند.

 نمونه‌‌ها از لحاظ مثبت یا منفی بودن رنگ‌‌آمیزی بررسی شده و در نمونه‌‌های مثبت، درصد ایمنوراکتیویتی سلول‌‌های بافت به صورت زیر ثبت شد:

(Score 0) کمتر از %10 سلول‌‌های اپی‌‌تلیالی رنگ‌‌پذیری غشایی را نشان دادند، (Score 1) درصد سلول‌‌های رنگ گرفته %25-10، (Score 2) درصد سلول‌‌های رنگ گرفته %50-25، (Score 3) درصد سلول‌‌های رنگ گرفته بیشتر از %50 است.⁽⁴⁾ سپس با استفاده از آزمون‌های کای اسکوئر، آنالیز واریانس یک عاملی، کروسکال والیس و من-ویتنی آنالیز‌های آماری صورت گرفت.

یافته‌ها

در این مطالعه، 45 نفر شامل 17 مرد (%8/37) و 28 زن (%2/62) با میانگین سنی 9/16± 2/53  سال و دامنه سنی 13 تا 86 سال مورد بررسی قرار گرفتند. افراد از نظر سن و جنس بین سه گروه مورد بررسی قرار گرفتند.

مقایسه گروهها از نظر توزیع جنس: در جدول1 مشاهده می‌‌گردد در گروههای لکوپلاکیای غیر دیسپلاستیک و لکوپلاکیای دیسپلاستیک تعداد زنان 9 نفر و تعداد مردان
 6 نفر بود، در حالیکه در گروه نرمال، تعداد زنان و مردان به ترتیب 10 و 5 نفر بود.  گروهها از نظر تعداد زنان و مردان اختلاف معنی‏داری نداشتند (971/0P=).

مقایسه گروهها از نظر سن بیماران: در جدول2 مشاهده می‌‌گردد جوان‏‏ترین و مسن‏ترین فرد به ترتیب در گروهای نرمال و لکوپلاکیای غیر دیسپلاستیک قرار داشتند. کمترین و بیشترین میانگین سنی به ترتیب متعلق به گروههای نرمال و لکوپلاکیای غیر دیسپلاستیک بود. گروه‏‏‏ها از نظر میانگین سنی اختلاف معنی‏داری نداشتند (732/0P=).

بررسی بیان EGFR: در مخاط نرمال، لکوپلاکیای غیردیسپلاستیک و لکوپلاکیای دیسپلاستیک:

 همان طور که در جدول 3 مشاهده می‌‌گردد، در گروه نرمال، فقط اسکور‏های 0و1 مشاهده شد که بیشترین فراوانی مربوط به اسکور صفر بود. در گروه لکوپلاکیای دیسپلاستیک اسکورهای 1 تا 3 مشاهده شد که بیشترین فراوانی مربوط به اسکور 3 بود. در گروه لکوپلاکیای غیر‏دیسپلاستیک نیز اسکورهای 1 تا 3 مشاهده شد که بیشترین فراوانی مربوط به اسکور 2 بود. سه گروه از لحاظ بیان مارکر اختلاف معناداری داشتند. (تصویر 3-1)
(001/0(P<

در مقایسه‌‌ی دو‌‌به‌‌دوی گروه‌‌ها مشخص گردید که متوسط اسکور رنگ‌‌پذیری در گروه‌‌های لکوپلاکیای دیسپلاستیک و لکوپلاکیای غیردیسپلاستیک به طور معنی‌‌داری از گروه نرمال بیشتر بود (001/0 P<و 002/0P=) و بین دو گروه لکوپلاکیای دیسپلاستیک و لکوپلاکیای غیردیسپلاستیک تفاوت آماری معنی‌‌داری مشاهده نشد(255/0P=).

ارتباط بین جنس و بیانEGFR: در جدول4 مشاهده می‌‌گردد تعداد اسکور صفر در مردان و زنان برابر و تعداد اسکورهای 1 و 2 در زنان و تعداد اسکور3 در مردان بیشتر بود. زنان و مردان از نظر بیان EGFR اختلاف معنی‏داری نداشتند (971/0P=).

ارتباط بین سن و بیان EGFR: سن و اسکور رابطه مثبت ولی ضعیف داشتند به این معنی که با افزایش سن، اسکور هم افزایش می‌‌یافت و بالعکس اما مقدار همبستگی بین آنها از نظر آماری معنی‏دار نبود (45=n، 279/0=Rsp، 064/0=P).

جدول1: توزیع فراوانی بیانEGFR برحسب گروه و جنس

جدول2: میانگین و انحراف معیار سن به تفکیک گروه‌های تحت مطالعه

جدول 3: توزیع فراوانی بیانEGFR به تفکیک گروه و نمره

جدول4: توزیع فراوانی بیانEGFR به تفکیک جنس

تصویر1: بیان EGFR در اپی‌‌تلیوم مخاط نرمال(اسکور1) (بزرگ‌‌نمایی  100×)

تصویر2: بیان EGFR در لکوپلاکیای غیردیسپلاستیک (اسکور2) (بزرگ‌‌نمایی 200×)

تصویر3: بیان EGFR در لکوپلاکیای دیسپلاستیک (اسکور3) (بزرگ‌‌نمایی 200×)

بحث

لکوپلاکیا شایعترین ضایعه پیش‌‌بدخیم دهانی است که دارای میزان عود بالا و پتانسیل تبدیل شدن به بدخیمی است. از خصوصیات ضایعات پیش‌‌بدخیم، مشاهده اپی‌‌تلیوم دیسپلاستیک توسط میکروسکوپ نوری است. تمام ضایعات دیسپلاستیک سیر بدخیمی را طی نمی‌‌کنند و بر عکس امکان تبدیل شدن به بدخیمی در برخی ضایعات غیر‌‌دیسپلاستیک به چشم می‌‌خورد. بنابراین تشخیص ضایعات با پتانسیل حقیقی برای تبدیل به یک ضایعه بدخیم چالش بزرگی می‌‌باشد. تعداد زیادی از سرطان‌‌های حفره دهان در مراحل اولیه از نظر بالینی به صورت ضایعات پیش‌‌بدخیم با پتانسیل تبدیل به بدخیمی تظاهر می‌‌یابند. استفاده از بیومارکرها جهت بررسی بیماری در مراحل اولیه سبب گسترش رویکردهای درمانی پیشگیری کننده به منظور ساپرس کردن بیماری در فاز اولیه می‌‌شود. تحقیقات در زمینه این مارکرها، که تکمیل کننده بررسی‌‌های هیستولوژیک معمول می‌‌باشند، ضروری به نظر می‌‌رسد.^(9و4) گیرنده فاکتور رشد اپیدرمال (Epidermal growth factor receptor/EGFR)، به عنوان یکی از بهترین نشانگرهای زیستی مورد مطالعه، نقش مهمی در کنترل تکثیر سلولی، آپوپتوز، آنژیوژنز و متاستاز دارد. فاکتور رشد اپیدرمال(EGF) در اپیتلیوم دهانی با اتصال به گیرنده EGFR اثر بیولوژیکی خود را اعمال می‌‌کند. EGFR از طریق آبشار تیروزین کیناز عمل کرده و دارای اهداف سیگنالینگ مرتبط با سرطان‌‌زایی است.⁽¹⁰⁾ EGFR فعال تعدادی مولکول سیگنالینگ را فعال کرده که منجر به فعال شدن چندین مسیر مهم برای رشد، پیشرفت و بقا تومور می‌‌شود.^(7-5) با توجه به مطالعات محدود و اهمیت این مارکر در دیسپلازی، در این مطالعه لکوپلاکیای دیسپلاستیک و غیردیسپلاستیک و بافت نرمال مورد مقایسه قرار گرفت. طبق نتایج، نمونه‌‌های لکوپلاکیای دهانی دیسپلاستیک و غیردیسپلاستیک و بافت نرمال بروز EGFR را با درجات مختلف نشان دادند و بین سه گروه مورد مطالعه تفاوت آماری معنی‌‌داری مشاهده گردید. درمقایسه‌‌ی دو‌‌به‌‌دوی گروه‌‌ها مشخص گردید که متوسط اسکور رنگ‌‌پذیری در گروه‌‌های لکوپلاکیای دیسپلاستیک و لکوپلاکیای غیردیسپلاستیک به طور معنی‌‌داری از گروه نرمال بیشتر بود. Riberio و همکاران⁽¹¹⁾، EGFR را بر روی 48 بیمار دارای لکوپلاکیا بررسی کردند. 28 بیمار دارای لکوپلاکیای غیردیسپلاستیک و 20 بیمار دارای لکوپلاکیای دیسپلاستیک بودند. این مارکر در 62. 5% از ضایعات مثبت بود، EGFR در وجود یا عدم وجود دیسپلازی یا بین افراد سیگاری و غیرسیگاری تفاوت معنی‌‌داری را نشان نداد. در مطالعه‌‌ی ما نیز این مارکر در گروه‌‌های لکوپلاکیا مثبت بود و در انواع دیسپلاستیک و غیردیسپلاستیک اختلاف آماری معنی‌‌داری نشان نداد.

 در مطالعه دیگری مارکر EGFR در ضایعات دارای دیسپلازی اپی‌‌تلیالی روی 29 بیمار مورد بررسی قرار گرفت که بیشتر بیماران سابقه جویدن پان یا نگه داشتن آن در مخاط باکال و وستیبول لب را داشتند. تمام نمونه‌‌های مخاط نرمال و دیسپلازی اپی‌‌تلیال ایمنوراکتیویتی مثبت را نشان دادند. به طور کلی، رنگ‌‌پذیری در مقایسه با مخاط کنترل در ضایعات دیسپلاستیک افزایش یافته بود.⁽¹²⁾ در مطالعه‌‌ی ما نیز درصد رنگ‌‌پذیری در لکوپلاکیای دیسپلاستیک و غیردیسپلاستیک بیشتر از بافت نرمال بود.  Mekaو همکاران⁽⁴⁾ EGFR را در لکوپلاکیا و فیبروز زیرمخاطی و بافت نرمال بررسی کردند و از نظر آماری تفاو معنی‌‌داری را گزارش کردند. نتایج این مطالعه به طور کامل با نتایج مطالعه ما هم‌‌خوانی دارد در مطالعه حاضر نیز در مقایسه بیان EGFR بین سه گروه اختلاف معنی‌‌داری وجود داشت. در مطالعه Singla  و همکاران⁽¹³⁾ مارکر EGFR روی 40 نمونه لکوپلاکیا و 40 نمونه OSCC بررسی شد. بیان EGFR در گروه‌‌های لکوپلاکیا و OSCC و کنترل تفاوت معنی‌‌داری داشت که با نتایج مطالعه ما هم‌‌خوانی دارد، به طوری که در مطالعه حاضر نیز در مقایسه بیان EGFR بین سه گروه اختلاف معنی‌‌داری وجود داشت. Mala⁽¹⁴⁾ درسال 2019 از EGFR به عنوان یک نشانگر تشخیصی اولیه بین دیسپلازی شدید و OSCC استفاده کرد که نمونه‌‌های مورد مطالعه شامل OSCC، ضایعات دیسپلاستیک و اپی‌‌تلیوم نرمال بود. نتایج از نظر آماری افزایش معنی‌‌داری در میزان رنگ‌پذیری ایمونوهیستوشیمی نشان داد. Mandal و همکاران⁽¹⁵⁾ مطالعه‌‌ای با هدف مقایسه و بررسی EGFR در مخاط دیسپلاستیک وOSCC به روش تکنیک ایمونوهیستوشیمی انجام دادند. طبق نتایج، این مارکر به عنوان اندیکاتور تشخیص در سرطان و همچنین تارگت‏درمانی در درمان‌‌های ضد سرطان معرفی شد. در مطالعه‌‌ی ما نیز به علت بیان بیشتر مارکر در گروه‌‌های لکوپلاکیا نسبت به گروه نرمال، می‌‌توانیم نتیجه بگیریم مارکرEGFR  می‌‌تواند اندیکاتور پروگنوستیک و همچنین هدف درمانی در درمان‌‌های ضد سرطان باشد.

نتیجه گیری

بر اساس نتایج این مطالعه از بافت نرمال به سمت لکوپلاکیای غیردیسپلاستیک و دیسپلاستیک، درصد رنگ‌‌پذیری و به طبع آن اسکور نیز افزایش یافت. بنابراین افزایش بیان EGFR به عنوان مارکر دخیل در رشد سلولی و سرطان، از بافت نرمال به سمت لکوپلاکیای غیردیسپلاستیک و دیسپلاستیک حاکی از نقش احتمالی این مارکر در روند کارسینوژنز است.

تشکر و قدردانی

این مقاله برگرفته از پایان نامه دکترای عمومی دندانپزشکی (99049) با کد اخلاق IR.MEDILAM.REC.1399.089
می باشد.

بدینوسیله از معاونت محترم پژوهشی دانشگاه علوم پزشکی مشهد به جهت تصویب و حمایت این طرح تشکر و قدردانی می‌شود.