مقدمه

آنوریسمال بون کیست (Aneurysmal bone cyst/ABC) به عنوان یک ضایعه ژانت سلی، نسبتاً نادر بوده و شامل تجمع فضاهای استخوانی پرخون با اندازه های متغیر در داخل استخوان می باشدکه توسط بافت همبندی واسکولاریزه وتا حدودی فیبروزه سلولار همراه با ژانت سل راکتیو و استخوان واکنشی احاطه می شود. پاتوژنز این ضایعه نامشخص است و محققان پیشنهاد کرده اند که حادثه تروماتیک، مالفورماسیون عروقی و یا نئوپلاسم، ممکن است روند طبیعی همودینامیک استخوان را مختل کرده و منجر به نواحی وسیع خونریزی و استئولیز شوند. به همین علت، 20 تا 30 درصد ABCها در ارتباط با ضایعات دیگر تشکیل می شوند، همچنین آن را مرتبط با ژانت سل گرانولوما دانسته اند.⁽¹⁾

ژانت سل گرانولومای محیطیperipheral giant cell granuloma/PGCG) ) به صورت یک ندول قرمز یا بنفش به طور انحصاری بر روی ریج لثه و آلوئولار ریج می باشد. منشأ این ضایعات از لیگامان پریودنتال یا موکوپریوستئوم ریج آلوئولار است. احتمالاً این ضایعه نئوپلاسم حقیقی نیست بلکه نوعی ضایعه واکنشی است که در اثر تروما یا تحریک موضعی پدید می آید. بروز بیشتر آن در زنان ممکن است تحت تأثیر هورمون‌های جنسی زنان باشد.^(2و1)

ژانت سل گرانولومای مرکزی(central giant cell granuloma/CGCG) در داخل استخوان های فک بروز می‌کند و اتیولوژی آن مورد بحث است.⁽²⁾ خانم‌ها بیشتر از آقایان مبتلا می‌شوند و در بیشتر موارد، این ضایعه بدون علامت و با رشد آهسته است، اما ضایعات مهاجم به واسطه علائمی چون درد، رشد سریع، تخریب کورتکس، تحلیل ریشه، جا به جایی دندان‌ها و تمایل به عود بعد از درمان، مشخص می‌شوند.^(3و1)

از لحاظ هیستوپاتولوژی، هر دو ضایعه PGCGs و CGCGs با حضور سلول‌های ژانت چند هسته ای (multinucleated giant cell/MGC) در پس زمینه سلول‌های مزانشیم تک هسته‌ای (mononucleated cell/MC) تشخیص داده می‌شوند. به رغم این شباهت هیستوپاتولوژی، CGCG و PGCG دارای عملکرد بیولوژیکی متمایز می‌باشند. PGCG به ندرت باعث خوردگی استخوان شده و به ندرت عود می‌کند، در حالی که CGCG دارای میزان رشد و عود بالاتر بوده و می‌تواند باعث تحلیل استخوان و پرفوریشن کورتکس گردد.⁽³⁾

آنژیوژنز فرآیند چند مرحله ای است که شامل تشکیل مویرگ های جدید از یک شبکه عروقی موجود با بازسازی ماتریکس خارج سلولی، مهاجرت سلول های اندوتلیال و تکثیر، تمایز مویرگی و آناستوموز است. آنژیوژنز ناشی از عدم تعادل بین عوامل پروتئین و آنژیوژنیک تولید شده از سلول های طبیعی و سلول های تومور است و از اهمیت حیاتی برای رشد، نگهداری و متاستاز تومورها برخوردار است.^(5و4)

پروتئین CD34 عضوی از خانواده پروتئین های بین غشایی سیالوموسین است که در سلول های خون ساز و بافت های مرتبط عروقی بیان می شود.⁽¹⁰⁾ CD34 یکی از نشانگرهای اندوتلیالی برای سنجش تراکم عروق خونی کوچک (microvessl density/MVD) می باشد. براساس گزارشات، این نشانگر توانایی تعیین سلول های پیش ساز و نیز تمایز یافته اندوتلیالی را دارد.⁽⁶⁾ رگ سازی نه تنها برای ادامه رشد تومور بلکه به عنوان یک فاکتور ضروری برای گسترش و رشد تومورها، اعم از خوش خیم و بدخیم مطرح می باشد. بدیهی است در صورت ثبات افزایش
رگ سازی درمان ضایعه به سمت کنترل رگ زایی گرایش خواهد یافت.⁽⁷⁾

MVD جهت بررسی تراکم عروق خونی کوچک در نئوپلاسم ها کاربرد دارد. MVD به طور واضح، آنژیوژنز تومور را نشان می دهد و به عنوان یک نشانگر، جهت تعیین پیش آگهی بالینی در تومورهای متعدد مورد بررسی قرار گرفته است. لذا MVD به عنوان مارکر پروگنوتیک بالقوه در تومورهای متعدد مطرح می باشد ⁽⁸⁾ بسیاری از مطالعات، ارتباط مثبتی بین MVD و عود مجدد تومور را نشان می دهند ⁽⁹⁾ رنگ پذیری سلول های اندوتلیال برای CD34 جهت ارزیابی آنژیوژنز و تراکم عروق شناخته شده است. اندازه گیری مقدار MVD توسط ایمونوهیستوشیمی یک روش معمول برای ارزیابی آنژیوژنز در انواع مختلف نئوپلازی می باشد ⁽¹⁰⁾

لذا هدف از مطالعه حاضر، بررسی نقش آنژیوژنز در ضایعات مورد مطالعه با رفتار بیولوژیک متفاوت، با استفاده ازنشانگر CD34 به روش ایمنوهیستوشیمی بود.

مواد و روش ها

در این مطالعه Ex-vivo تعداد 38 نمونه بیوپسی شامل 30 نمونه ژانت سل گرانولومای محیطی و مرکزی فکین (هرکدام 15 نمونه) و 8 نمونه آنوریسمال بون کیست استخوان، از آرشیو بخش آسیب‌شناسی دانشکده دندانپزشکی مشهد و بیمارستان قائم^(عج) انتخاب شدند. بیماران دارای ضایعات استخوانی همراه با هیپرپاراتیروئیدیسم که توسط آزمایش خون و سرم مربوطه تأیید شده بودند، وارد مطالعه نگردیدند. همچنین اطلاعات بالینی بیماران مربوطه شامل سن و جنس، استخراج گردید. بلوک‌های پارافینی نمونه‌های مورد مطالعه در این تحقیق پس از بازبینی توسط پاتولوژیست‏های طرح و نشانه‌گذاری کانون مناسب در لام، از آرشیو گرفته شد. این بلوک‌ها دارای بیشترین حجم بافتی و مناسب جهت انجام تکنیک‌های ایمونوهیستوشیمی بودند. نمونه‌های کنترل مثبت شامل بافت همانژیوم از آرشیو بیمارستان قائم^(عج) مشهد تهیه شد. نمونه ها علاوه بر کنترل مثبت خارجی، واجد کنترل مثبت داخلی نیز بوده اند. نمونه‌های کنترل منفی شامل نمونه‌های مورد مطالعه بودند که آنتی‏بادی اولیه در طی کار روی آنها استفاده نگردید. پس از بررسی مورفولوژیک توسط دو نفر از اساتید بخش پاتولوژی از هر بلوک پارافینی دو برش بافتی به ضخامت 4-3 میکرون تهیه شد. برش های مذکور از نظرکمیت و کیفیت کانون های تشخیصی تایید شد و نمونه ها جهت بررسی دانسیته عروق کوچک (MVD) براساس واکنش آنتی ژن- آنتی بادی، توسط نشانگر CD34 (mouse anti-CD34, ready to use, clone QBEnd/10) با استفاده از روش ارائه شده توسط شرکت سازنده کیت(Novocastra) رنگ آمیزی شدند. کیت رنگ‌آمیزی مورد استفاده در مطالعه حاضر Novo Link Polymer detection system بود. به منظور بازیافت آنتی ژنی، اسـلایدها تحـت حرارت در بافر سیترات سدیم 01/0 مول با 6 PH= قرار گرفته و سپس به مدت نیم ساعت در دمای اتاق انکوبه شدند. سپس پراکسیداز اندوژن توسط پراکسید هیدروژن 3 % بلوک گردید و نمونه های رنگ آمیزی شده توسـط دو پاتولوژیـست بدون آگاهی از نوع ضایعه، توسط میکروسکوپ نوری (Labomed) مورد مطالعه قرار گرفت و فوتو گرافی با دوربین Canon متصل به میکروسکوپ Leica انجام شد. ایمونوراکتیویتی برای ضایعات آنوریسمال بون کیست در 2 ناحیه شامل بوردر حفره ABC و عروق سپتا فیبروزه بررسی شد.⁽¹⁾ جهت تعیین MVD، ایمونو راکتیویتی نمونه ها ابتدا با درشت نمایی پایین (100×) جهت تعیین نواحی با بالاترین میزان واسکولیشن (hotspot) بررسی شد. سپس با بزرگنمایی بالا (400×)، 5 فیلد میکروسکوپی به صورت تصادفی انتخاب و تعداد رگ ها در هر HPF شمارش شد. MVD برای هر نمونه توسط میانگین 5 فیلد شمارش شده، محاسبه گردید. در هریک از گروه های مورد مطالعه نیز جهت مقایسه میانگین محاسبه شد. سپس با استفاده از آزمون های آماری مقایسه بین گروه ها انجام شد.

یافته ها

در این تحقیق تعداد 38 نمونه مربوط به 38 بیمار شامل 25 زن (8/65 درصد) و 13 مرد (2/34 درصد) با میانگین سنی 57/17±28/31 سال و دامنه سنی 5/2 تا 85 سال از نظر MVD در ضایعات ABC و CGCG و PGCG مورد بررسی قرار گرفتند. ابتدا نرمال بودن متغیرهای کمی، بررسی شد. تعداد بیماران زن در هریک از سه گروه PGCG, CGCGC, ABC به ترتیب 4(50درصد)، 11 (3/73 درصد) و 10 (7/66 درصد) و تعداد بیماران مرد در این گروه ها به ترتیب 4 (50 درصد)، 4 (7/26 درصد) و 5(3/33 درصد) بود. میانگین سنی در هر یک از گروه های فوق به ترتیب 1/24±6/30 و 6/18±2/32 و 3/13±7/30 سال بود. آزمون آنالیز واریانس یک عاملی برای سن (968/0P=) و جنس (503/0P=) تفاوت معناداری را نشان نداد. متغیر سن و جنس در همه گروهها همگن بود.

بررسی دانسیته عروق کوچک در گروه های مورد مطالعه:

میانگین MVD در گروه PGCG، 22/9±42/26، در گروه CGCG، 33/10±53/31 و در گروه ABC، 35/5±00/31 بود. گروه ها از نظر میانگین MVD با یکدیگر اختلاف
معنی داری نداشتند (270/0p=). لازم به ذکر است در نمونه های ABC هیچ یک از نمونه ها، ایمونوراکتیویتی در بوردر حفره نشان نداد. رنگ پذیری CD34 برای عروق موجود در سپتای فیبروزه جهت بررسی MVD محاسبه شد (جدول 1) (تصاویر 1 تا 3).

تصویر 1 : بیان CD34 در ژانت سل گرانولومای مرکزی (بزرگنمایی 100×)

تصویر 2 : بیان CD34 در ژانت سل گرانولومای محیطی (بزرگنمایی 100× و 200×)

تصویر 3 : بیان CD34 درآنوریسمال بون کیست (بزرگنمایی 200×)

ارتباط دانسیته عروق کوچک با جنس به تفکیک
گروه های مورد مطالعه:

در جدول 2، شاخص های میانگین، انحراف معیار، کمترین و بیشترین مقدار MVD به تفکیک جنس و گروه آورده شده است. همانگونه که مشاهده می گردد در گروه PGCG، میانگین و انحراف معیار در زنان 15/9 ± 30/24 و در مردان 71/8 ±60/30 بود که از نظر آماری اختلاف
معنی داری با یکدیگر نداشتند(224/0P=). در گروه CGCG، میانگین و انحراف معیار MVD در زنان 92/9±45/29 و در مردان 50/10±25/37 بود که از نظر آماری اختلاف معنی داری با یکدیگر ندارند (207/0p=). در گروه ABC، میانگین و انحراف معیار MVD در زنان 35/4±75/33 و در مردان 25/5±25/28 بود که از نظر آماری اختلاف معنی داری با یکدیگر نداشتند(158/0=p).

ارتباط MVD با سن به تفکیک گروه های مورد مطالعه:

در جدول 3 مشاهده می گردد در گروه های PGCG و ABC، سن با MVD ارتباط ضعیف از نوع مستقیم دارد (یعنی با افزایش یا کاهش سن، MVD نیز افزایش یا کاهش می یابد) اما در گروه CGCG، ارتباط ضعیف از نوع معکوس دارد (یعنی با افزایش یا کاهش سن، MVD کاهش یا افزایش می یابد) اما در هیچ گروهی مقدار ارتباط بین دو متغیر معنی دار نبود.

جدول 1 : میانگین و انحراف معیار MVD درگروه های مورد مطالعه

جدول 2 : میانگین و انحراف معیار MVD بین زنان و مردان به تفکیک گروه های مورد مطالعه

جدول 3 : همبستگی سن با متغیر MVD به تفکیک گروههای مورد مطالعه

بحث

در مطالعه حاضر جهت بررسی نقش آنژیوژنز و دانسیته عروقی در ضایعات ژانت سلی با رفتار بیولوژیک متفاوت، MVD در سه گروه ضایعات مورد مطالعه قرار گرفت. اتیولوژی CGCG هنوز موضوع بحث است. با وجودی که ژانت سل گرانولومای مرکزی و محیطی دارای ویژگی های هیستوپاتولوژیک مشابه هستند، اما رفتار بالینی آنها متفاوت است. CGCG با طیف گسترده ای از تظاهرات از
پیشرفت های بدون علامت، آهسته تا جابجایی دندان و عود مجدد تشخیص داده می شود و این ضایعه نشان دهنده رفتار تهاجمی تر و تحلیل بیشتر استخوان نسبت به PGCG است.^(12و11) آنوریسمال بون کیست به عنوان یک ضایعه ژانت سلی، نسبتاً نادر بوده و پاتوژنز این ضایعه نامشخص است. محققان پیشنهاد کرده اند که تروما، مالفورماسیون عروقی و یا نئوپلاسم ممکن است روند طبیعی همودینامیک استخوان را مختل کرده و منجر به نواحی وسیع خونریزی و استئولیز شوند. ⁽¹⁾ همان طور که اشاره شد؛ آنژیوژنز در این ضایعات مورد بررسی قرار گرفت زیرا آنژیوژنز برای ادامه رشد تومور ضروری بوده است و رگ سازی یک امر ضروری برای گسترش و رشد تومورها، اعم از خوش خیم و بدخیم می باشد و بدون دسترسی به سیستم رگی، تومور نمی تواند گسترش یابد. ⁽⁷⁾

آنژیوژنز، ناشی از عدم تعادل بین عوامل پروتئین و آنژیوژنیک تولید شده از سلول های طبیعی و سلول های تومور است و از اهمیت حیاتی برای رشد، نگهداری و متاستاز تومورهای توپر برخوردار است. ⁽⁷⁾ ایجاد عروق جدید اثر دوگانه ای بر رشد تومور دارد؛ جریان خون، اکسیژن و مواد غذایی را تأمین می کند و سلول های اندوتلیال تازه تشکیل شده با ترشح پلی پپتیدهایی نظیر عوامل رشد شبه انسولین و ..... رشد سلول های توموری را تحریک می کنند. ⁽⁴⁾ رنگ پذیری سلول های اندوتلیال توسط CD34 جهت ارزیابی آنژیوژنز و MVD شناخته شده است. اندازه گیری مقدار MVD توسط ایمونوهیستوشیمی یک روش معمول برای ارزیابی آنژیوژنز در انواع مختلف نئوپلازی است. ⁽¹⁰⁾

Melo-Moniz و همکاران⁽¹³⁾ به بررسی آنژیوژنز و ماکروفاژ ها با استفاده از روش ایمنوهیستوشیمی در ضایعات مهاجم و غیر مهاجم CGCG پرداختند. آنها پیشنهاد کردند با وجود نقش این دو عامل در گسترش این ضایعات، تفاوت معناداری بین دو گروه مشاهده نشد. در مطالعه حاضر نیز ارتباط معناداری بین گروه ها گزارش نشد که با نتایج مطالعه فوق هم خوانی دارد.

Sadri و همکاران ⁽¹⁴⁾ بررسی CGCG و PGCG را با استفاده از آنتی بادی های مونوکلونال CD34 و CD31 انجام دادند. در این مطالعه آنژیوژنز با ارزیابی MVD توسط نشانگر های اندوتلیال فوق به روش ایمونوهیستوشیمی مورد بررسی قرار گرفت. بر اساس نتایج، بررسی MVD با هر دو نشانگر CD34 و CD31 در CGCG نسبت به PGCG به طور معناداری بیشتر بود، که با مطالعه ما از لحاظ بالاتر بودن در CGCG همخوانی دارد. ⁽¹⁴⁾

Kumar و همکاران ⁽⁴⁾ به بررسی آنژیوژنز با ماکروفاژها توسط ارزیابی بیان CD34 و CD68 در PGCG و CGCG پرداختند. میزان متغیر رگ های خونی و ماکروفاژ در CGCG نسبت به PGCG بیشتر بود. در مطالعه ما میزان دانسیته رگ های خونی در ژانت سل گرانولومای مرکزی بیشتر از نوع محیطی بود ولی ارتباط معناداری مشاهده نشد. در مطالعه فوق همبستگی بین MVD و شاخص ماکروفاژ در میان این دو ضایعه از نظر آماری معنی دار نبود. آنژیوژنز و همچنین تعداد ماکروفاژها در CGCG افزایش یافته گزارش شد. این یافته ها نشان داد که احتمالاً ماکروفاژها آنژیوژنز را در این نوع ژانت سل گرانولوما تحریک کرده و آنژیوژنز ممکن است در رفتار بالینی نقش داشته باشد.

Atarbashi و همکاران ⁽¹⁰⁾ مطالعه ای جهت مقایسه بیان CD34  بین CGCG مهاجم و غیرمهاجم فک ها به منظور بررسی نقش احتمالی پاتوژنز عروقی در رفتار بیولوژیک این ضایعات انجام دادند. بیان CD34 در گروه مهاجم بالاتر از گروه غیرمهاجم بود، اما هیچ تفاوت آماری معناداری مشاهده نشد که با نتایج مطالعه حاضر هم خوانی دارد. ما نیز با وجودی که اختلاف معنی داری بین نوع محیطی و مرکزی مشاهده نکردیم، اما MVD در ژانت سل گرانولومای مرکزی با میانگین 53/31 بیشتر از نوع محیطی با میانگین 40/26 گزارش شد.

برخلاف مطالعه فوق، Peacock و همکاران⁽¹⁵⁾ نشان دادند میزان رنگ پذیری در گروه CGCG مهاجم بالاتر از گروه غیرمهاجم بود. این محققان ارتباط بین بیان CD34 و تهاجم ضایعات را گزارش کردند. افزایش تراکم عروق ممکن است به افزایش جذب و تمایز سلول های خونی به استئوکلاست ها منجر شود، و سبب استئولیز سریعتر در ضایعات مهاجم می شود، لذا عروق کرونر و سطح آنژیوژنز در ضایعات مهاجم بالاتر از ضایعات غیرمهاجم است که دلالت بر نقش آنژیوژنز در رفتار بالینی مهاجم تر این ضایعات دارد.

Hallikeri و همکاران⁽¹⁶⁾ به بررسی آنژیوژنز و حضور ماکروفاژها توسط مارکرهای CD34 و CD68 در PGCG و CGCG به روش ایمونوهیستوشیمی پرداختند. تغییرات میانگین MVD در میان گروه ها نشان داد که آنژیوژنز ممکن است یکی از مکانیسم های احتمالی در رفتار مختلف بیولوژیکی باشد و الگوی رشد را تحت تأثیر قرار دهد. در این مطالعه مشخص شد که آنژیوژنز و حضور ماکروفاژ در CGCG نسبت به PGCG بیشتر بود و تفاوت آماری
معنی داری داشتند. در مطالعه حاضر نیز CGCG تراکم عروق خونی بیشتری نسبت به  PGCG نشان دادند.

همچنین Dewsnup و همکاران⁽¹⁷⁾ نیز به مقایسه بیان CD34 در ضایعات ژانت سلی مهاجم و غیرمهاجم و شناسایی ارتباط بین تراکم عروقی تومور و رفتار بیولوژکی آن پرداختند. نتایج این مطالعه نشان داد که میزان
رنگ پذیری CD34 و میزان آنژیوژنز در ضایعات مهاجم در مقایسه با ضایعات غیرمهاجم افزایش یافته است.

مطالعه ای دیگر توسط Etemad-Moghadam و همکاران ⁽¹⁸⁾ برای ارزیابی میزان رنگ پذیری CD 34 جهت پیش بینی رفتار بالینی ضایعات ژانت سلی در طی یک دوره 15 ساله شامل 32 نمونه انجام شد. در این تحقیق، 26 ضایعه مهاجم و 6 ضایعه غیرمهاجم بود و نتایج نشان داد که تراکم رنگ پذیری CD34 در 5/2 % موارد به طور معنی داری در ضایعات مهاجم بیشتر از ضایعات غیرمهاجم بود.

Shinde و همکاران ⁽¹⁹⁾ به بررسی بیان مارکرهای عروقی در آنوریسمال بون کیست پرداختند. در این مطالعه 25 مورد کیست استخوانی آنوریسم با انواعی از مارکرهای واسکولار شامل آنتی بادی های فاکتور 8، VEGF-C، GLUT-1، Smooth muscle cell (SMC) و D2-40 و CD34 به روش ایمنوهیستوشیمی بررسی شد. در 12% موارد، بوردر حفره ABC با آنتی بادی CD34 واکنش نشان داد، اما رنگ پذیری بیشتر در عروق سپتا فیبروزه مشاهده شد. لازم به ذکر است در مطالعه حاضر در هیچ یک از نمونه ها بوردر آنوریسمال بون کیست ایمونوراکتیویتی نشان نداد و میزان عروق خونی گزارش شده در سپتای فیبروزه تقریبا مشابه با ضایعات ژانت سل گرانولومای مرکزی بود.

نتیجه گیری

طبق یافته های مطالعه حاضر، بررسی دانسیته عروقی از طریق بیانCD34 نمی تواند نشان دهنده تفاوت در رفتار بیولوژیک ضایعات ژانت سلی باشد که لزوم تحقیقات گسترده تر در این زمینه را ضروری می سازد. با توجه به اینکه تاکنون مطالعه ای به مقایسه آنوریسمال بون کیست با این ضایعات نپرداخته؛ تحقیقات بیشتری برای تشریح پاتوژنز و طبیعت این ضایعات ژانت سلی ضروری است و دیگر نشانگرها باید به منظور پاسخ به این سئوال که آیا این ضایعات نشان دهنده تکامل یک فرآیند پاتولوژیک هستند یا خیر، مورد بررسی قرار گیرد.

تشکر و قدردانی

بدینوسیله از معاونت محترم پژوهشی دانشگاه علوم پزشکی مشهد، به جهت تصویب و حمایت این طرح تشکر و قدردانی می شود.