مقدمه

پوسیدگی دندانی یکی از شایع ترین بیماری‌های مزمن و قابل پیشگیری در سراسر جهان است. به صورت کلی پوسیدگی را در اثر برهم‌کنش بین فلور دهانی عامل پوسیدگی با کربوهیدرات‌های قابل تخمیر روی سطوح دندانی با گذشت زمان در نظر می‌گیرند. مطالعات متعددی تغییر در تعادل گونه‌های میکروارگانیسم در حضور پوسیدگی را نسبت به سطوح بدون پوسیدگی نشان می‌دهند.^(3-1)

استرپتوکوکوس موتانس طبق مطالعات اپیدمیولوژیک متعددی با پوسیدگی دندانی مرتبط است و به نظر می‌رسد این باکتری گرم مثبت، نقش اصلی را در آغاز پوسیدگی ایفا می‌کند. هم‌چنین مطالعات متعدد با استفاده از تکنیک‌های مولکولی پیشرفته نشان داده‌اند که لاکتوباسیل‌ها در نواحی پیشروی ضایعات پوسیده قرار داشته و احتمالاً این باکتری‌ها با پوسیدگی عاج در ارتباط هستند.^(5و4)

 استفاده از گیاهان دارویی برای اهداف درمانی قرن‌ها است که صورت می‌پذیرد. با این وجود تنها قریب به 20 درصد از گیاهان موجود در جهان از جهت فارماکولوژیکی و بیولوژیکی آزمایش‌ و تایید شده‌اند. با توجه به مقاومت نسبی به آنتی‌بیوتیک‌ها در میان میکروفلور طبیعی دهان به خصوص استرپتوکوک‌های گروه ویریدانس و رویکردهای اخیر طب در بهره‌گیری از گیاهان دارویی، تا کنون اثربخشی گیاهان مختلفی مانند Japanese Green Tea، Piper betel و Plantago Major Leaves بر این باکتری‌ها سنجیده شده است.^(8-6)

 هندوانه ابوجهل با نام علمی Citrulus Colocynthis و نام عربی حنظل، گیاهی است علفی و چند ساله با ساقه‌های خوابیده بر روی زمین و گاهی بالا رونده. میوه که قسمت مورد استفاده گیاه است به شکل کروی و به اندازه یک پرتقال معمولی به رنگ زرد، زرد متمایل به سبز و یا سبز رنگ است. قسمت داخل میوه سفید رنگ، اسفنجی و بسیار تلخ و حاوی دانه‌های متعدد و بیضی شکل می‌باشد که پس از رسیدن به رنگ قهوه‌ای در‌می‌آیند.⁽⁹⁾

مهم‌ترین ترکیب میوه گلیکوزیدی است که در سال 1818 استخراج و شناسایی شد و کولوسینتین نام گرفت. این ماده بسیار تلخ و در آب و الکل محلول است و اثرات میوه نیز مربوط به این ماده می‌باشد. این ماده به مقدار بسیار کم ممکن است در دانه‌ها وجود داشته باشد.⁽⁹⁾

بر اساس مطالعات انجام شده عصاره‌ی گیاه هندوانه ابوجهل دارای اثر آنتی‌باکتریال علیه باکتری‌های گرم مثبت و گرم منفی از جمله Escherichia Coli, Pseudomonas Aeruginosa, Staphylococcus Aureus و Enterococcus faecalis می باشد.⁽¹⁰⁾

در پژوهش حاضر در مسیر تبدیل شبه علم به علم، با توجه به استفاده گسترده از عصاره‌ی گیاه هندوانه ابوجهل و با در نظر گرفتن محدود بودن پژوهش‌های مستند در مورد اثر این گیاه بر باکتری استرپتوکوکوس موتانس و عدم وجود پژوهش مستند مربوط به اثر این گیاه بر باکتری لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس، هدف بررسی اثر واقعی آنتی‌میکروبیال آن بر باکتری‌های فوق بوده است. به همین منظور و برای مقایسه، از یک آنتی بیوتیک موثر بر این باکتری ها (سیپروفلوکساسین) استفاده شده است. مسلماً در صورت ادامه تحقیقات و نتایج مثبت در این پژوهش در گام های بعدی به مقایسه اثرات این گیاه با دهانشویه هایی از قبیل کلرهگزیدین پرداخته خواهد شد.

مواد و روش‌ها

تهیه سوسپانسیون باکتری: سویه‌های استاندارد باکتری‌ها به صورت کشت فعال (Streptococcus Mutans (IBRC-M: 10682) Lactobacillus Acidophilus (IBRC-M:10815) از مرکز ملی ذخایر ژنتیکی و زیستی ایران تهیه شد. از باکتری‌هایی که در پلیت کشت داده شده بود (کشت تازه 48-24 ساعته) در محیط براث تلقیح شد (برای استرپتوکوکوس موتانس محیط BHI براث استریل (Brain Heart Infusion) و برای لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس محیط MRS (De Man, Rogosa and Sharpe agar) و پس از آن به مدت 48 ساعت در جار بی‌هوازی در دمای 37 درجه سانتی گراد نگهداری شد. سپس سوسپانسیون باکتری مطابق 5/0 مک فارلند تهیه شد.

آنتی بیوتیک سیپروفلوکساسین نیز در رقت‌های 1 به 2 که در آن هر غلظت حاوی ماده‌ی مؤثره‌ای به اندازه‌ی نصف غلظت قبلی خود بود، از 128 میکروگرم بر میلی لیتر تا 0625/0 میکروگرم بر میلی لیتر مورد استفاده قرار گرفت.⁽¹¹⁾

تهیه عصاره‌ی میوه هندوانه ابوجهل: گیاه به صورت تازه و در فصل بهار از عطاری معتبر در شهر قم تهیه شد و ضمن تطبیق شکل و ویژگی‌های ظاهری آن با کتاب گیاهان دارویی صالحی سورمقی⁽⁹⁾ که از منابع معتبر و قابل استناد در این زمینه می‌باشد، به تایید سرکار خانم دکتر هدی ابولحسنی استادیار دانشگاه علوم پزشکی قم رسید.

برای تهیه عصاره‌ی آبی و الکلی هندوانه ابوجهل، ابتدا میوه بالغ و رسیده این گیاه خشک و سپس با آسیاب پودر شد. پودر میوه هندوانه ابوجهل توسط ترازوی دیجیتال مدل PCB 3500-2 با دقت 01/0 گرم ساخت کمپانی KERN آلمان به میزان g 5 توزین شد. پس از قرار گرفتن پودر مورد نظر در ارلن، با نسبت 1 به 20، cc 100 آب مقطر و اتانول 96 درصد⁽¹²⁾ به عنوان حلال روی پودر ریخته شد تا کاملا روی پودر را بپوشاند. سپس در ارلن پوشانده شد و محلول‌ها برای مدت 48 ساعت در دستگاه تکان دهنده (Shaker) در دمای اتاق قرار گرفت. این روش عصاره گیری خیساندن (ماسراسیون) نام دارد.⁽¹²⁾

پس از 48 ساعت محلول‌های مورد نظر با استفاده از کاغذ صافی، صاف شده و محلول همگن حاصل جهت تبخیر حلال در دمای اتاق قرار گرفت. مواد باقی‌مانده در ظرف پس از تبخیر حلال عصاره‌ی آبی و الکلی هندوانه ابوجهل است. با استفاده از این روش، 504/1 گرم عصاره خشک آبی و 617/1 گرم عصاره خشک اتانولی به دست آمد.

• تهیه رقت‌های سریال از عصاره میوه هندوانه ابوجهل: برای تهیه رقت‌های سریال از عصاره هندوانه ابوجهل که حالت خشک و پودری دارد از حلال DMSO Dimethyl Sulfoxide)) محصول شرکت مرک آلمان استفاده شد. برای حفظ خاصیت عصاره‌ها و استریل کردن آن‌ها از وجود هرگونه آلاینده (از قبیل باکتری‌ها و ویروس‌ها) از فیلتر سرسرنگی 22 میکرونی محصول شرکت jet biofil استفاده شد. پس از آن عصاره‌ی هندوانه ابوجهل با رقت‌های سریال 1 به 2 که در آن هر غلظت حاوی ماده‌ی مؤثره‌ای به اندازه‌ی نصف غلظت قبلی خود بود، از 16384 تا 8 میکروگرم در میلی‌لیتر تهیه شده و در چاهک‌های میکروپلیت 96 خانه‌ای از هر رقت، میزان 100 میکرولیتر اضافه شد. هم‌چنین از آنتی بیوتیک سیپروفلوکساسین در رقت‌های 1 به 2، از 128 میکروگرم بر میلی لیتر تا 0625/0 میکروگرم بر میلی لیتر به عنوان کنترل مثبت استفاده شد.^(14و13و11)

تهیه محیط کشت مولر هینتون براث با غلظت مضاعف: محیط کشت با غلظت مضاعف دارای غلظت دو برابر محیط کشت ساده است. برای این منظور باید نسبت آب مقطر اضافه شده به محیط کشت نصف میزان توصیه شده برای تهیه محیط کشت ساده باشد. سپس محیط کشت در دمای 121 درجه سانتی گراد استریل و در دمای 4 درجه سانتی گراد خنک شد.

تعیین میزان MIC ترکیبات مورد استفاده برای هر گونه باکتریایی: ابتدا به همه خانه ها 100 میکرولیتر محیط کشت با غلظت مضاعف اضافه شد و به ترتیب در خانه‌های 1 تا 12، 100 میکرولیتر از رقت‌های 1 به 2 ی تهیه شده در مرحله قبل اضافه گردید. سپس درون تمام چاهک‌ها 100 میکرو لیتر از سوسپانسیون باکتری با غلظت 5/0 مک فارلند اضافه گردید، که در مجموع با توجه به دو مرتبه تکرار برای هر یک از عصاره‌ها و آنتی‌بیوتیک و هم‌چنین 2 گونه‌ی مختلف باکتری و 12 رقت عصاره‌ها، 120 چاهک استفاده شد که به همین منظور 2 عدد میکروپلیت 96 خانه‌ای مورد استفاده قرار گرفت.(تصویر 1)

تصویر 1 : AL : عصاره الکلی، W: عصاره آبی،

C: سیپروفلوکساسین

در آخر میکروپلیت‌ها در جار بی هوازی به مدت 48 ساعت در دمای 37 درجه قرار داده شد.

بعد از گرمخانه گذاری، میزان MIC عصاره میوه­ی هندوانه ابوجهل و داروی مورد استفاده به طریق چشمی تعیین و گزارش شد. کمترین غلظتی از عصاره یا دارو که در آن رشد باکتری مشاهده نشد، به عنوان MIC آن ترکیب گزارش شد. اخیرا روش‌های دیگری از جمله روش میکروتیتر نیمه-اتومات جایگزین لوله‌ها شده‌اند. هرچند نظر نهایی در تمامی شیوه‌ها مشاهده عدم رشد در یکی از چاهک‌ها است که تحت عنوان MIC گزارش می‌شود.⁽¹⁵⁾

کنترل مثبت حاوی محیط کشت و باکتری بود که نشان‌دهنده این بود که محیط کشت استفاده شده سالم بود.

کنترل منفی محیط کشت، عصاره و آنتی‌بیوتیک حاوی محیط کشت به همراه سرم فیزیولوژی استریل، محیط کشت به علاوه عصاره و محیط کشت به علاوه آنتی‌بیوتیک بود که نباید رشد داشته باشد و نشان‌دهنده استریل شدن صحیح محیط کشت، عصاره‌ها و آنتی‌بیوتیک است.

برای اطمینان از زنده و سالم بودن باکتری‌ها و سالم بودن محیط کشت، 100 میکرو لیتر از سوسپانسیون باکتری با غلظت 5/0 مک فارلند که 100 مرتبه با سرم فیزیولوژی رقیق شده بود، به 100 میکرولیتر از محیط کشت مولر هینتون براث اضافه شد و به مدت 48 ساعت در دمای 37 درجه‌ی سانتی‌گراد در جار بی هوازی نگه‌داری شد. پس از 48 ساعت، محیط کشت کاملا آثار کدورت و رشد باکتری‌ها را در خود نشان داد که این امر نشان‌دهنده‌ی سالم و زنده بودن باکتری‌ها و هم‌چنین سالم بودن محیط کشت بود.

یافته‌ها

مطالعه‌ی حاضر به بررسی اثر آنتی‌باکتریال دو گروه عصاره‌ی آبی و الکلی گیاه هندوانه ابوجهل بر باکتری‌های استرپتوکوکوس موتانس و لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس پرداخته است. برای این منظور محیط‌های کشت به صورت چشمی و از نظر کدورت در رقت‌های مختلف بررسی شدند که نتایج آن به تفکیک برای هر یک از باکتری‌های ذکر شده به شرح زیر می‌باشد. لازم به ذکر است که علامت + و – به ترتیب به معنای رشد و عدم رشد باکتری است.

برای اطمینان از صحت نتایج به دست آمده هر یک از مراحل فوق در چاهک‌های جدید تکرار شد که مجددا نتایج مشابه مرحله‌ی قبل کسب شد.

هم‌چنین برای کنترل منفی، غلظت‌های مختلف آنتی‌بیوتیک سیپروفلوکساسین بر باکتری‌های استرپتوکوکوس موتانس و لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس سنجیده شد که نتایج آن در ادامه آمده است.

جدول 1 : اثر عصاره‌ی آبی و الکلی هندوانه ابوجهل بر باکتری لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس و استرپتوکوکوس موتانس

جدول 2 : اثر غلظت‌های مختلف سیپروفلوکساسین بر استرپتوکوکوس موتانس

جدول 3 : کنترل محیط کشت، باکتری‌ها و عصاره‌ها

بحث

در مطالعه‌ی حاضر عصاره‌‌ی الکلی گیاه هندوانه ابوجهل تنها در غلظت µg/ml 16384‌ بر باکتری لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس اثر ضد باکتریایی داشت و هم‌چنین عصاره‌ی آبی نیز در غلظت‌های µg/ml 16384 و µg/ml 8192 مانع رشد این باکتری شده بود. با وجود این که این تفاوت از نظر آماری چندان معنادار نیست، اما می‌توان اینگونه نتیجه گرفت که حلال آب در استخراج مواد مؤثره‌ی هندوانه ابوجهل نسبت به اتانول بهتر عمل کرده است، هر چند برای تایید این نظر انجام مطالعات بیشتر ضرورت دارد. از آنجا که غلظت‌های ذکر شده برای یک ماده‌ی آنتی‌باکتریال مقادیر بسیار بالایی هستند می‌توان این‌گونه نتیجه گرفت که با وجود بالاتر بودن اثر آنتی‌باکتریال عصاره‌ی آبی هندوانه ابوجهل نسبت به عصاره‌ی الکلی آن بر باکتری لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس، هر دوی این عصاره‌ها فاقد اثر آنتی باکتریال مشخص بر باکتری مذکور می‌باشند.

عصاره‌‌ی الکلی گیاه هندوانه ابوجهل در غلظت‌های µg/ml 16384 و µg/ml 8192‌ بر باکتری استرپتوکوکوس موتانس اثر ضد باکتریایی داشته و هم‌چنین عصاره‌ی آبی نیز در غلظت‌های µg/ml 16384 و µg/ml 8192 مانع رشد این باکتری شده بود. از آنجا که غلظت‌های ذکر شده برای یک ماده‌ی آنتی‌باکتریال مقادیر بسیار بالایی هستند می‌توان این‌گونه نتیجه گرفت که عصاره‌های آبی و الکلی گیاه هندوانه ابوجهل فاقد اثر آنتی باکتریال مشخص بر استرپتوکوکوس موتانس می‌باشند.

در مطالعه‌ی Bnyan و همکارانش⁽¹⁶⁾ بیش‌ترین اثر بازدارندگی رشد عصاره‌ی اتانولی هندوانه ابوجهل به ترتیب بر باکتری‌های Escherichia Coli، Proteus mirabilis و Staphylococcus aureus بوده‌ است. کم‌ترین میزان بازدارندگی رشد متعلق به باکتری Streptococcus agalactia بود و این عصاره بر باکتری‌های Streptococcus pneumoniae، Streptococcus mutans و Klebsiella pneumonia اثری نداشته است. عصاره‌ی آبی نیز بر هیچ‌یک از باکتری‌های مذکور اثری نداشت.

بر اساس مطالعه‌ی کفشگری و همکارانش⁽¹⁷⁾ رشد استرپتوکوکوس موتانس و کاندیدا آلبیکنس به طور مؤثری توسط عصاره‌ی آبی و الکلی هندوانه ابوجهل محدود می‌شود. علت تناقض در نتایج این مطالعه با مطالعه‌ی حاضر میتواند مربوط به تفاوت در روش عصاره‌گیری باشد. چنان که میزان پودر میوه‌ی هندوانه ابوجهل مورد استفاده برای عصاره‌گیری بسیار بیشتر از مقادیر مورد استفاده در پژوهش حاضر بوده است.

بر اساس نتایج مطالعه‌ی Thangavel و Ramasamy⁽¹⁸⁾ عصاره‌ی متانولی برگ هندوانه ابوجهل پتانسیل اثرات ضدباکتریایی و ضد قارچی علیه باکتری‌های گرم مثبت (Staphylococcus aureus، Streptococcus pneumoniae و Bacillus subtilis) و گرم منفی (Klebsiella pneumoniae، Shigella dysenteriae و Escherichia coli) و گونه‌های قارچی (Candida albicans) نشان داد.

Belsem Marzouk و همکارانش⁽¹⁹⁾ نشان دادند خواص دارویی عصاره‌ی اتانولی (Ethanopharmacological) هندوانه ابوجهل با توجه به مرحله‌ی بلوغ گیاه متفاوت می‌باشد و بازده آنتی‌باکتریال عصاره‌ی میوه و دانه تفاوت معنی‌داری دارد. اثر عصاره‌ی ساقه و ریشه‌ی این گیاه به مراتب کم‌تر از عصاره‌ی میوه و دانه‌ی آن بود و کم‌ترین میزان اثر آنتی‌باکتریال متعلق به عصاره‌ی ریشه‌ی گیاه بود. همچنین در حلال‌های مختلف قسمت‌های متفاوتی از گیاه بیش‌ترین اثر آنتی‌باکتریال را دارند.

Hussain و همکارانش⁽²⁰⁾ اثر 10 گیاه دارویی مختلف بر 5 باکتری را سنجیدند، که در میان این گیاهان دارویی، گیاه هندوانه ابوجهل نیز قرار داشت. طبق نتایج این پژوهش، عصاره‌ی اتانولی هندوانه ابوجهل بر باکتری‌های Staphylococcus aureus و Corynebacterium bovis بی اثر بود ولی مانع رشد سایر باکتری‌ها یعنی Pasteurella multocida، Escherichia Coli و Bacillus cereus شد.

Najafi و همکارانش⁽²¹⁾ نشان دادند اثر ضدباکتریایی عصاره‌ی خام آبی و اتانولی هندوانه ابوجهل وابسته به دوز بوده و عصاره با غلظت mg/ml 5 اثر آنتی‌باکتریال بیش‌تری نسبت به غلظت mg/ml 5/2 بر باکتری Staphylococcus aureus دارد. غلظت‌های پایین‌تر هیچ اثر ضد باکتریایی بر این باکتری نشان ندادند. میزان بازدارندگی رشد عصاره‌ی اتانولی میوه‌ی گیاه بیش‌تر از عصاره‌ی اتانولی برگ آن بود.

Priyavardhini و همکاران⁽²²⁾ نشان دادند عصاره‌ی کلروفروم و استون هندوانه ابوجهل دارای اثر ضد باکتریایی مشخص بر باکتری‌های Staphylococcus aureus، Escherichia coli، Pseudomonas aeruginosa، Klebsiella pneumonia و Serratia marcescens بودند که از این میان بیش‌ترین میزان مهارکنندگی رشد مربوط به باکتری Pseudomonas aeruginosa بود. تفاوت در نتایج مطالعات مختلف می‌تواند به علت متفاوت بودن مرحله‌ی بلوغ گیاه استفاده شده، روش‌های عصاره ‌گیری و روش بررسی اثر آنتی‌باکتریال باشد.

نتیجه‌گیری

میزان مهارکنندگی عصاره‌های آبی و الکلی هندوانه ابوجهل برای باکتری استرپتوکوک موتانس یکسان بود و با توجه به بالا بودن غلظت‌های مؤثر بر این باکتری هیچ‌یک از عصاره‌های آبی و اتانولی هندوانه ابوجهل بر این باکتری اثر ضدباکتریایی نداشتند. در مورد باکتری لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس نیز با وجود بالاتر بودن اثر آنتی‌باکتریال عصاره‌ی آبی هندوانه ابوجهل نسبت به عصاره‌ی الکلی آن بر این باکتری، هر دوی این عصاره‌ها فاقد اثر آنتی باکتریال مشخص بر باکتری مذکور می‌باشند؛ ولی با توجه به عدم رشد باکتری ها در چاهک با غلظت µg/ml 16384، می‌توان این غلظت را به عنوان غلظت دارای اثر آنتی‌باکتریال معرفی کرد.

تشکر و قدردانی

بدینوسیله از سرکار خانم سارا موسایی که در انجام مراحل آزمایشگاهی این پژوهش یاریمان کردند، قدردانی می گردد. این پژوهش برگرفته از پایان‌نامه دکتری حرفه ای دندانپزشکی به شماره IR.MUQ.REC.1399.031 است.