مقدمه

پریودنتیت یک بیماری عفونی و التهابی بافتهای حمایت کننده دندان می باشد^(2و1) که توسط میکروارگانیسم های خاص یا گروهی از میکرو ارگانیسم ها ایجاد می شود⁽¹⁾ و در صورتیکه درمان نشود منجر به تخریب پیشرونده بافت های ساپورت کننده دندان و متعاقب آن از دست رفتن دندان می شود.⁽²⁾تغییر در مونوسیت های محیطی با کاهش واکنش پذیری لنفوسیت یا افزایش پاسخ B Cell مرتبط است. سنتز مدیاتور
پیش التهابی (TNF-α, IL1α, IL-6, IL-8, PGE2) توسط B Cell، ماکروفاژ، PDL، فیبروبلاست لثه و سلولهای اپی تلیال منجر به تغییر در پاسخ ایمنی ذاتی یا آداپتیو در نواحی پریودنتال می شود.^(5-1)

TLR4 (Toll like Receptor4) یکی از رسپتورهای اختصاصی تشخیص دهنده پاتوژن (PAMPs Pathogen Associated Pattern) می باشد که لیپوپلی ساکاریدهای باکتری های گرم منفی، بعضی از ساختارهای محافظت شده قارچی تا پاتوژن های مایکو باکتریایی و برخی از لیگاندهای داخلی را تشخیص می دهد.⁽⁵⁾مدارک متعددی از ارتباط بیولوژیکی TLR4 در پاتوژنز بیماری پریودنتال حمایت می کنند.⁽⁶⁾ آبشار پیام رسانی TLR4 بوسیله اتصال لیگاند (LPS) به دومن خارجی سلولی TLR4 شروع می شود.^(9-7) میانجی گری MyD88 در پیام رسانی TLR4 عمدتاً در غشاء های پلاسمایی اتفاق می افتد و شامل فسفریلاسیون کینازهای مرتبط با IL-1R، ارتباط فاکتور 6 مرتبط با رسپتور TNF و سیگنال های پایین دست می باشد که منجر به فعال سازی NF-kB و القاء واسطه های پیش التهابی همانند TNF و IL-6 می شود⁽¹⁰⁾مشخص شده که ماکروفاژها سطوح بالایی از TLR4 را بیان می کنند و این سلولها در لثه هنگامیکه با LPS فعال می شوند سایتوکاین های پیش التهابی را تولید می کنند.⁽¹¹⁾ بنابراین ماکروفاژها یک نقش کلیدی در شروع پاسخ های التهابی میزبان از طریق فعال سازی TLR4 بوسیله LPS بازی می کنند.⁽¹²⁾TLR4 به خاطر نقشش در سیستم ایمنی یک کاندید ژنی خوب برای بیماری پریودنتال به حساب می آید. مدارک متعددی از ارتباط بیولوژیکی TLR4 در پاتوژنز بیماری پریودنتال حمایت می کنند. TLR ها در تشخیص باکتری های گرم منفی همانند لیپوپلی ساکارید (LPS) پورفیروموناس جینجیوالیس که یک پاتوژن اصلی پریودنتال است، دخیل می باشند.⁽¹³⁾ پروتئین های شوک حرارتی (HSP) خانواده پروتئین هایی هستند که در پاسخ به مواجهه با شرایط استرس زا توسط سلول ها تولید می شوند. آنها برای اولین بار در رابطه با شوک گرما توضیح داده شده اند، اما امروزه همچنین در هنگام استرس های دیگر از جمله قرار گرفتن در معرض سرما، نور اشعه ماوراء بنفش و هنگام بهبود زخم یا بازسازی بافت و همچنین در بیماریهایی که ارتباط مستقیمی با التهاب دارند، بیان می شود. این افزایش بیان به صورت رونویسی تنظیم می شود. تنظیم چشمگیر پروتئین های شوک حرارتی بخش مهمی از واکنش شوک حرارتی است و در درجه اول توسط فاکتور شوک حرارتی القا می شود. HSPs تقریباً در همه موجودات زنده، از باکتریها گرفته تا انسان یافت می شود.⁽¹⁴⁾ پروتئین های شوک حرارتی با توجه به وزن مولکولی آنها نامگذاری می شوند. به عنوان مثال، HSP60، HSP70 و HSP90 (پرکاربردترین HSP ها) به ترتیب به اندازه 60، 70 و 90 کیلودالتون به خانواده های پروتئین های شوک حرارتی مراجعه می کنند. پروتئین کوچک 8 کیلوکالتون اوبیوکیتین، که پروتئین را برای تخریب علامت گذاری می کند، همچنین دارای پروتئین شوک حرارتی است. دامنه اتصال پروتئین حدود 80 کریستالی آلفا اسیدآمینه به عنوان پروتئین های شوک حرارتی کوچک شناخته شده است.⁽¹⁵⁾ پروتئین کینازها (MAPK) نقش اساسی در مراحل سلولی مختلف شامل تکثیر، تمایز، پاسخ های استرسی، التهاب، آپوپتوز و دفاع ایمنی بازی می کنند.⁽¹⁶⁾MAPK یکی از مسیرهای اصلی پیام رسانی در T-cell ها می باشد که فعالیت های سلولی و ترجمه را تنظیم می کند.⁽¹⁷⁾ در این مطالعه ما بر آن شدیم تا در مرحله اول با استخراج سلولهای التهابی مثل ماکروفاژها از بافتهای التهابی لثه، بیان TLR4 را اندازه گیری کنیم و همچنین با اندازه گیری میزان TLR4 مکانیسم اثر HSP70 را بر روی مسیرها شناسایی کنیم تا ببینیم HSP70 با چه مکانیسمی اثر التهاب را افزایش می دهد.

مواد و روش ها

در این مطالعه بنیادی – کاربردی، در 50 نفر از بیماران با محدوده سنی 25 تا 70 سال که حداقل 12 دندان (بدون در نظر گرفتن مولرهای سوم و بریج، کرون و ایمپلنت) حضور داشتند و نیز بیماران با تشخیص پریودنتیت مزمن جنرالیزه متوسط تا شدید با حضور 30 درصد دندان ها که به درمانگاه دندانپزشکی بخش پریو در تبریز مراجعه کرده بودند وارد مطالعه شدند. نوع جراحی پاکت تراپی از نوع رزکتیو بود. بیماران از نظر سیستمیک سالم بودند و رضایتنامه آگاهانه را تکمیل نموده بودند. بیماران دارای بیماری های سیستمیک (مثل دیابت ملیتوس، کانسر، ایدز، بیماری های متابولیک استخوانی) و یا بیماری هایی که ترمیم زخم را به تعویق می اندازند، سابقه رادیوتراپی یا درمان های سرکوبگر سیستم ایمنی، بیماری های اتوایمیون، آلرژی و بیماری های عفونی دیگر، حاملگی یا شیردهی، سابقه مصرف آنتی بیوتیک در دو ماه گذشته، تاریخچه مصرف مداوم NSAIDs، سابقه جرمگیری و تسطیح ریشه در یک سال گذشته، از مطالعه خارج شدند.

مطالعه حاضر در کمیته اخلاق دانشکده پزشکی دانشگاه آزاد واحد تبریز مطرح و با کد IR.IAU.TABRIZ.REC.1395.4 مورد تائید قرار گرفت. نمونه های بافتی از بیماران مبتلا به پریودنتیت مزمن جنرالیزه متوسط تا شدید در حین جراحی حذف یا کاهش عمق پاکت بدست آمد. روش برداشت بافت به صورت فلپ ساب مارژینال بود. با توجه به اینکه حداقل ابعاد مورد نیاز mm1×mm3 بود، در مواردی که عمق پاکت از mm5 بیشتر بود، بافت های لثه ای حاصل از فلپ ساب مارژینال در محیط نرمال سالین جهت بررسی به آزمایشگاه ایمونولوژی ارسال شد.

جهت استخراج سلول و تحریک با پروتئین شوک حرارتی 70، بافت در داخل محیط کشت DMEM توسط کاتر جراحی شماره 10 به چند قطعه بریده شد و ذرات بریده شده به همراه کلاژناز 10 درصد وارد فالکون شده و بمدت 8 ساعت داخل یخچال قرار گرفت. پس از سانتریفیوژ و جدا شدن آنزیم ها، سلول ها در محیط کشت در فلاسک قرار داده شدند و در انکوبه °c 37 به مدت 2 روز نگهداری شدند، سپس شستشو داده شده و با مارکر CD14 توسط فلوسایتومتری شمارش شدند. سلولها بوسیله پپتید HSP70 به صورت تایمر h2، h4، h8، h12، h24 تحریک شدند، سپس mRNA سلولی بوسیله تریزول استخراج شده و با استفاده از دستگاه Real time PCR  Rotogen (شرکت کیوتو ژاپن) میزان TLR4  در سلولهای ماکروفاژ مورد بررسی قرار گرفت. β-actic بعنوان کنترل انتخاب گردید. همچنین مقداری از خود بافت نیز با پرایمر TLR4 و β-actic بصورت مستقیم برای کنترل با تکنیک Real time PCR مورد بررسی قرار گرفت.

بافت های پریو بعد از لیزشدن روی ژل SDSPage 12% الکتروفورز شده و بر روی صفحات ترانسفر PVDF ترانسفر گردیدند. صفحات با شیر بدون چربی 5 درصد همراه با Tween 1 درصد در داخل PBS بمدت یک ساعت در دمای اتاق بلوکه شدند و سپس به مدت یک شبانه روز بوسیله آنتی بادی anti-MARKanti-NF-KB که از شرکت AbcamChina),(Nanjing خریداری شده بود انکوبه گردیدند. میزان اثر بوسیله نرم افزار (Amercontrol Biosciences, USA) Amercontrol اندازه گیری شد.

نتایج مطالعه با استفاده از روش های آمارتوصیفی میانگین، انحراف معیار و توزیع فراوانی توصیف شدند. در مسیرهای MAPK و NF-KB در ساعات مختلف از آزمون اندازه گیری های تکراری (Repeated measurement) استفاده شد. همچنین جهت مقایسه این میزان بین دو مسیر و در ساعات مختلف از آنالیز کواریانس ANOVA استفاده گردید. آنالیزآماری بااستفاده از نرم افزار SPSS با ویرایش 17 انجام شد و سطح معنی داری 05/0 در نظرگرفته شد. جهت مقایسه مدت زمان بین دو گروه از آزمون t-test و برای کنترل از GAPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) استفاده گردید.

یافته ها

سلول ها بعد از ایزوله و تحریک شدن با HSP70 توسط پرایمر های TLR4 مورد آنالیز قرار گرفتند. نتایج حاصل نشان داد که در سلول های ماکروفاژ، میزان بیان TLR4 با تحریک HSP70 افزایش پیدا می کند که این میزان افزایش با افزایش مدت زمان بیشتر بود و در 12 ساعت بعد از تحریک به اوج خود می رسید که نشان دهنده ارتباط معنی دار بین TLR4 و HSP70 بود (001/0>P) (شکل 1). برای بررسی میزان TLR4 به صورت مستقیم در بافت پریودنتیت و نرمال، میزانی از بافت به صورت مستقیم توسط Real time PCR با پرایمر TLR4 چک شد. نتایج نشان داد که در بافت مبتلا به پریودنتیت، ارتباط معنی داری بین بافت التهابی و TLR4 وجود دارد (0001/0>P) (شکل 2).

شکل 1 : افزایش بیان TLR4 با تحریک تایم کورس سلولها توسط HSP70 در بیماران پریودنتیت

شکل 2 : مقایسه میزان بیان TLR4 در دوگروه سالم و بیماران پریودنتیت

برای بررسی ارتباط بین HSP70 با NF-KB و MAPK روش وسترن بلات برای اندازه گیری میزان پروتئین ها بکار برده شد. نتایج حاصل نشان داد که میزان NF-KB و MAPK در حضور HSP70 بیشتر می شود ولی با استفاده از anti-HSP70 که HSP70 را مهار می کند، میزان NF-KB و MAPK کاهش می یابد که این کاهش در NF-KB محسوس تر می باشد. (شکل 3)

 .

شکل 3 : مقایسه دو مسیر MAPK , NF-KB با تحریک HSP70 و Anti-HSP70

بحث

پریودنتیت یک بیماری عفونی و التهابی بافتهای حمایت کننده دندان می باشد که نوع مزمن آن بیشتر در بالغین دیده می شود و به عنوان یک بیماری التهابی با پیشرفت آهسته در نظر گرفته می شود.⁽¹⁾ از آنجا که پریودنتیت مزمن فرم شایع پریودنتیت می باشد در این مطالعه جمعیت بیماران مبتلا به پریودنتیت مزمن جنرالیزه متوسط تا شدید مورد بررسی قرار گرفت. ماکروفاژها سطوح بالایی از TLR4 را بیان می کنند و این سلولها در لثه هنگامی که با LPS فعال می شوند، سایتوکاین های پیش التهابی را تولید می کنند.⁽¹⁵⁾ بیان TLR4 در اپی تلیوم لثه و فیبروبلاست لثه ای از نقش آن در بیماری پریودنتال حمایت می کند.⁽¹⁴⁾ در واقع نقش ژن TLR4 در بیماری پریودنتال بوسیله تنظیم افزایشی TLR4 در اپی تلیوم لثه⁽¹⁶⁾ و فیبروبلاست های لثه انسان آشکار می شود⁽¹⁵⁾ در مطالعه حاضر مشخص شد که ارتباط معنی داری بین TLR4 و HSP70 وجود دارد.

در اینجا، ما نشان دادیم که HSP70 می تواند به سطح TLR4 متصل شود. LV و همکاران⁽¹⁸⁾، Hsp70 را به عنوان آنتاگونیست جدید TLR4 معرفی کرد. به خوبی شناخته شده است که هر دو مسیر MAPK و NF-κB برای پاسخ ایمنی ناشی از TLR ضروری هستند.

مطالعه Zhu و همکارانش⁽¹⁹⁾ نشان داد که HSP70 می تواند بلوغ DCs را تشدید کند و DC را برای تولید سیتوکین هایی مانند IL-12، IL-1β و TNF-α فعال کند.

در مطالعه حاضر گزارش شده است که فعال سازی مسیرهای التهابی در بیان TLR4 ناشی از LPS دخیل است. برای تعیین اینکه آیا این مسیرهای سیگنال در تنظیم بیان TLR2 و TLR4 در اثر شوک گرما نقش دارند، سلولهای ماکروفاژ با HSP70 تحت درمان قرار گرفتند. این مطالعه در مقایسه با مطالعه Zhang و همکاران⁽²⁰⁾ که بر روی شوک حرارتی 90 و TLR2 بررسی شده بود نتایج یکسانی داشت.

مطالعه ای که فاطمی و همکاران⁽²¹⁾ بر روی تأثیر ابتلا به پریودنتیت مزمن بر میزان بیان ژن TLR-2 و TLR-4 در بافت لثه ای داشت، نشان داد که بیماری پریودنتال به طور معنی‏داری سبب افزایش بیان ژن TLR-2 و TLR-4 در بافت‏های لثه‏ای می‏گردد. در مطالعه ای که صندوقچیان و همکاران⁽¹⁵⁾ بر روی بررسی نقش سلول های ماکروفاژ در التهاب کانال دندانی داشتند، نشان داده اند که سلولهای ماکروفاژ بعد از استخراج بوسیله پروتئین های TLR4 بصورت تایمر تحریک شده می توانند بیان التهاب را افزایش دهند.

 مطالعات بر روی سایتوکاین ها نشان داده است که TLR4 می تواند سایتوکایین ها را زیاد کند. به طور کلی فاکتور‏های متعددی در پاتوژنز ضایعات پالپی نقش دارند.^(19-16) موسوی و همکاران⁽²²⁾ وجود Natural Killer Cell (NKC)‏ها را در پالپ ملتهب اثبات کردند، در حالی که در پالپ نرمال این سلول‏ها یافت نشده بودند. در مطالعه حاضر ارتباط بین HSP70 با TLR4 و MAPK را بررسی کردیم تا اثر این سایتوکاین را در مسیرهای TLR4 و MAPK ارزیابی کنیم. نتایج حاصل نشان داد که میزان TLR4 و MAPK در حضور HSP70 بیشتر می شود ولی با استفاده از anti-HSP70 که مهارکننده HSP70 است میزان TLR4 و MAPK کاهش یافت. بنابراین مطالعه حاضر نشان دهنده تأثیر HSP70 در افزایش فعال سازی مسیرهای TLR4 و MAPK می باشد. نمونه گیری و پیگیری بیماران پریودونتیت، محدودیت اصلی این مطالعه بود که برای نمونه گیری ها از تیم دندانپزشکی استفاده شدو نمونه ها در بانک سلولی ذخیره شد. پیشنهاد می شود پروتئین های شوک حرارتی دیگر بر روی بیان رسپتورهای سیستم ایمنی بررسی می شود. همچنین پیشنهاد می شود اثر پروتئین های شوک حرارتی بر روی سلولهای ماکروفاژ و لنفوسیت های T نیز بررسی گردد.

نتیجه گیری

با توجه به نتایج مطالعه حاضر، نتیجه گیری می شود که HSP70 در بیماری پریودنتیت افزایش بیان داشته است که این افزایش با تحریک پذیری مسیرهای MAPK و TLR4 می تواند بیشتر شود.

تشکر و قدردانی

کلیه آزمایشات این مطالعه در مرکز تحقیقات ایمونولوژی دانشگاه علوم پزشکی تبریز انجام شده است، که بدینوسیله قدردانی می گردد.