مقدمه

لکوپلاکیا بنا به تعریف WHO عبارت است از: پلاک یا لکه (Patch) سفیدی که از لحاظ بالینی یا آسیب‏شناسی به هیچ ضایعه دیگری اطلاق نشود و نتوان آن را از روی مخاط پاک کرد.^(4-1) به علت اینکه لکوپلاکیا محدوده وسیعی از یک هایپرکراتوز خوش‏خیم تا یک سرطان سلول سنگفرشی مهاجم را دربرمی‏گیرد، بیوپسی برای تشخیص قطعی الزامی می‏باشد. مانند اکثر ضایعات سفید دهانی، رنگ ضایعه در نمای بالینی، ناشی از ضخیم‏شدن لایه کراتین سطحی یا ضخیم‏شدن لایه خاردار می‏باشد.^(3-1)

لکوپلاکیا معمولاً به عنوان یک ضایعه پیش‏بدخیم یا پیش‏سرطانی در نظر گرفته می‏شود. شیوع تغییرات بدخیمی این ضایعات بیشتر از مخاط طبیعی است.⁽¹⁾           

تغییرات هیستوپاتولوژیک از یک هایپرکراتوز، دیسپلازی تا کارسینوم درجا و سرطان سلول سنگفرشی متفاوت است.^(3و1)

از لحاظ میکروسکوپی، لکوپلاکیا به وسیله یک لایه ضخیم کراتین روی اپی‏تلیوم سطحی (هایپرکراتوز)، همراه یا بدون افزایش ضخامت لایه خاردار (آکانتوزیس) مشخص می‏شود. برخی از لکوپلاکیاها در عین حال که هایپرکراتوز سطحی دارند، آتروفی یا نازک شدن اپی‏تلیوم زیرین را نشان می‏دهند. اغلب در بافت همبندی زیرین، تعداد متفاوتی از سلول‏های آماسی مزمن مشاهده می‏شوند.^(3و1)

دیسپلازی اصولاً در اپی‏تلیوم دیده می‏شود و با مجموعه‏ای از تغییرات شامل عدم یک شکل بودن سلول‏ها و نیز از بین رفتن نظم ساختاری آنها مشخص می‏شود. همچنین سلول‏های دیسپلاستیک تفاوت قابل توجهی در شکل (پلی‏مورفیسم) از خود نشان می‏دهند و اغلب دارای هسته‏های هیپرکروماتیک می‏باشند و نسبت اندازه هسته به سیتوپلاسم به طور غیرطبیعی بزرگ می‏باشند. اشکال میتوزی بیشتر از حد عادی دیده می‏شوند. به طور شایع میتوز در نواحی غیرطبیعی در اپی‏تلیوم ظاهر می‏شود.⁽⁵⁾ اکثر ضایعات لکوپلاکیایی در بیوپسی هیچ گونه تغییر دیسپلازی را نشان نمی‏دهند. شواهد مبنی بر وجود دیسپلازی اپی‏تلیال تنها در 5% تا 25% موارد (در صورت احتساب کلیه نقاط دهان) دیده شده است. در صورتی که دیسپلازی حضور داشته باشد، این تغییرات دیسپلاستیک معمولاً از قسمت‏های بازال و پارابازال اپی‏تلیوم آغاز می‏شوند. هر قدر اپی‏تلیوم بیشتر دیسپلاستیک گردد، تغییرات غیرمعمول اپی‏تلیال به سوی درگیری کل ضخامت اپی‏تلیوم وسعت می‏یابند.^(3و1)

در مطالعه‏ای که توسط Warnakulasuriya و همکارانش در سال 2008 بر روی سیستم‏های طبقه بندی دیسپلازی دهانی انجام شد، پیشنهاد شده است به علت اختلاف در بین پاتولوژیست‏ها در تصمیم‏گیری برای وجود دیسپلازی و شدت آن، بهتر است از سیستم جدید طبقه‏بندی دوتایی (بدون دیسپلازی، مشکوک، ریسک پایین/ متوسط تا شدید و متمایل به ریسک بالا) استفاده کرد. به نظر می‏رسد کاهش میزان انتخاب از سیستم سه‏تایی به دوتایی، باعث افزایش میزان توافق در بین پاتولوژیست‏ها می‏شود. میزان کارآیی این سیستم باید در آینده ارزیابی شود.⁽⁶⁾

PCNA[1]، یک پروتئین با وزن مولکولی 36 کیلودالتون می‏باشدو در اوایل فاز G1 و فاز S از چرخه سلولی ساخته می‏شود. این پروتئین همچنین در ارتباط با مکانیسم‏های تخریب و ترمیم DNA می‏باشد. PCNA بطور قوی با مناطق هسته‏ای که در آن سنتز DNA اتفاق می‏افتد مرتبط می‏باشد

PCNA یک مارکر مفید در پرولیفراسیون سلولی است چون تظاهر و انتشار آن با میزان پرولیفراسیون سلولی و سنتز DNA مرتبط می‏باشد.

P53 یک مهارکننده ذاتی رشد سلولی می‏باشد و شکل جهش یافته آن در ایجاد تومور نقش دارد.^(8و7) ژن سرکوب کننده تومور P53 اثرات مهارکننده رشد خود را حداقل تا حدی به وسیله تنظیم افزایشی تولید مهارکننده کینازهای وابسته به سیکلین اعمال می‏کند. موتاسیون این ژن و افزایش پروتئین آن در کارسینوم‏های سر و گردن مشاهده می‏گردد.^(5و3) Soares و همکارانش در سال 2006 یک مطالعه گذشته نگر بر روی 95 بیوپسی دهانی انجام دادند که 27 نمونه فیبروز هیپرپلازی، 40 نمونه لکوپلاکیا و 28 نمونه کارسینوم سلول‏های سنگفرشی دهانی بود. از 40 نمونه لکوپلاکیا، 16 مورد غیردیسپلاستیک و 24 مورد دیسپلاستیک بودند که 50% آنها دیسپلازی متوسط تا شدید داشتند. مقایسه بین این 4 گروه نشان داد که P53 و Ki67 به ترتیب در ضایعات خوش‏خیم، پیش‏بدخیم و بدخیم افزایش داشت. در مقابل ارتباط بین افزایش سطح PCNA و ضایعات پیش‏بدخیم و بدخیم غیرممکن بود و در نتیجه آنها نتیجه گرفتند که PCNA مارکر خوبی برای نشان دادن ضایعات پیش‏سرطانی نمی باشد.⁽⁹⁾

هدف از این مطالعه تعیین و مقایسه بروز آنتی ژن P53 و

PCNA در لکوپلاکیای مخاط دهان با و بدون دیسپلازی و اپی‏تلیوم طبیعی مخاط دهان به روش ایمونوهیستوشیمی بود.

مواد و روش‏ها

در این مطالعه توصیفی-تحلیلی که به صورت مقطعی اجرا گردید، نمونه‏ها از آرشیو دانشکده دندانپزشکی مشهد بخش آسیب‏‏شناسی تهیه شد. نمونه‏های مورد مطالعه شامل 63 بلوک موجود در بایگانی بخش آسیب‏‏شناسی دانشکده دندانپزشکی مشهد بود. 53 مورد از این 63 بلوک، مربوط به لکوپلاکیا (17 مورد بدون دیسپلازی، 15 مورد با دیسپلازی خفیف، 14 مورد با دیسپلازی متوسط و 7 مورد با دیسپلازی شدید) و 10 مورد مربوط به مخاط طبیعی دهان بود. ولی به دلیل آماسی بودن بافت همبندی مربوط به مخاط طبیعی دهان در اکثر موارد، نتوانستیم نمونه‏های بیشتری تهیه نماییم.

پس از بازبینی نمونه‏ها توسط دو پاتولوژیست و نشانه‏گذاری کانون مناسب از هر بلوک پارافینی دو برش 4 میکرونی جهت رنگ‏آمیزی ایمونوهیستوشیمی برای مشخص شدن میزان بروز پروتئین‏های P53 و PCNA طبق دستورالعمل کارخانه سازنده (Novo Castra) تهیه گردید.

روش رنگ آمیزی: پس از تهیه برش‏های بافتی از بلوک‏های پارافینی به ضخامت 4 میکرون، آنها را بمدت 24 ساعت در حرارت اتاق قرار دادیم. سپس آنها را در گزیلن دپارافینه کرده و سپس مراحل رنگ‏آمیزی را براساس دستورالمعل کارخانه سازنده (Novo Castra) بدینگونه انجام دادیم: به منظور بازیافت آنتی‏ژنی ابتدا آنها را در محلول سیترات در ماکروویو به مدت 35 دقیقه قرار دادیم. سپس آنها را با آب‏مقطر شسته و آنها را در محیط مرطوب گذاشتیم و پس از آن به ترتیب در محلول‏های پراکسیداز، آنتی‏بادی
(PCNA, P53)، Link، استرپتاویدین، کروموژن، هماتوکسیلین گذاشته و در بین هریک از مراحل فوق، به مدت 5 دقیقه آنها را در آب‏مقطر شستشو دادیم. سپس در الکل مطلق قرار داده و با چسب انتلان چسباندیم. اسلایدهای رنگ‏آمیزی شده زیر میکروسکوپ نوری با درشت نمایی 400´ و 100´ تحت مطالعه قرار گرفته و با استفاده از مقایسه با نمونه شاهد مثبت (آدنوکارسینوم کولون، گره لنفی راکتیو) از صحت رنگ‏آمیزی اطمینان حاصل گشت. برای ارزیابی فعالیت نشانگر P53 نمونه‏هایی که کمتر از 5% سلول‏های اپی‏تلیالی آنها رنگ گرفته بود به عنوان (-)، نمونه‏هایی که 25-6% سلول‏های اپی‏تلیالی آنها رنگ گرفته بود به عنوان (+) در نظر گرفته شدند. نمونه‏هایی که 50-26% سلول‏های اپی‏تلیالی آنها رنگ گرفته بود به عنوان (++) در نظر گرفته شدند.⁽¹⁰⁾ در نهایت چنانچه بیش از 50% سلول‏های اپی‏تلیالی رنگ می‏گرفت به عنوان (+++) در نظر گرفته می‏شد. برای ارزیابی فعالیت نشانگر PCNA، تعداد سلول‏های مثبت در حداقل 1000 سلول در مناطقی با حداکثر فعالیت PCNA شمارش گردید و تعداد سلول‏های مثبت به شکل درصدی از کل سلول‏های شمارش شده برآورد شد (Label Index).⁽¹¹⁾

از لحاظ شدت رنگ پذیری نشانگرها، رنگ پذیری هسته سلول‏های تومورال به 4 دسته عدم بروز (-) ضعیف (قهوه‏ای کم رنگ+)، متوسط (قهوه‏ای بلوطی ++) و شدید (قهوه‏ای سوخته +++) تقسیم‏بندی شدند.⁽¹²⁾

موقعیت بروز P53 و PCNA به تفکیک محل در اپی‏تلیوم در 1) طبقه بازال، 2) در طبقه بازال و پارابازال، 3) در 3/1 ضخامت اپی‏تلیوم، 4) در 2/1 ضخامت اپی‏تلیوم، 5) در 3/2 ضخامت اپی‏تلیوم، 6) در تمام ضخامت اپی‏تلیوم مشخص گشت.

آزمون‏های آماری مورد استفاده عبارت بود از آزمون‏های آنالیز واریانس یک طرفه، کروسکال-والیس و ضریب همبستگی اسپیرمن. در همه آزمون‏ها سطح معنی‏داری 05/0 بود.

 یافته‏ها  

 اکثریت نمونه‏های بافت نرمال و لکوپلاکیای بدون دیسپلازی، پروتئین P53 را در طبقه بازال بروز دادند (به ترتیب 50% و 5/76%) و همچنین اکثریت نمونه‏های لکوپلاکیا با دیسپلازی خفیف، P53 را در ناحیه بازال بروز دادند (7/66%). این ارقام در مورد لکوپلاکیا با دیسپلازی متوسط (4/21%) و مربوط به ناحیه بازال و پارابازال و برای لکوپلاکیا با دیسپلازی شدید (9/42%) و مربوط به کل ضخامت اپی‏تلیوم بود (تصویر 1).

در نهایت 40% نمونه‏های نرمال و 6/17% لکوپلاکیای بدون دیسپلازی P53 را بروز دادند. با توجه به آزمون کروسکال-والیس اختلاف معنی‏داری از لحاظ درجه بندی P53 در بین گروه‏های تحت مطالعه وجود داشت (001/0P<). با توجه به این آزمون اختلاف معنی‏داری از لحاظ درجه‏بندی P53 در بین انواع لکوپلاکیا وجود داشت (001/0P<). همچنین اختلاف معنی‏داری از لحاظ درجه‏بندی P53 در بین سه گروه مخاط نرمال، لکوپلاکیا بدون دیسپلازی و لکوپلاکیاهای با دیسپلازی به عنوان یک مجموعه وجود داشت (001/0P<) (جدول 1).

تمامی نمونه‏ها PCNA را بروز دادند. بیشترین میانگین درصد بروز PCNA در بین گروه‏های تحت مطالعه در لکوپلاکیا با دیسپلازی شدید (5/12±1/87) و کمترین میزان آن در لکوپلاکیا بدون دیسپلازی (1/7±06/15) دیده شد و با توجه به آنالیز واریانس یک طرفه اختلاف آماری معنی‏داری از لحاظ بروز PCNA بین گروه‏های تحت مطالعه وجود داشت (001/0P< و 395/50F=).

بر طبق آزمون، اختلاف آماری معنی‏داری از لحاظ بروز PCNA در بین انواع لکوپلاکیا وجود داشت (001/0P< و 752/54F=). همچنین اختلاف آماری معنی‏داری از لحاظ بروز PCNA بین سه گروه مخاط نرمال، لکوپلاکیا بدون دیسپلازی و مجموعه لکوپلاکیاهای با دیسپلازی وجود داشت (001/0P< و 728/8F=). با توجه به آزمون کروسکال-والیس اختلاف آماری معنی‏داری از لحاظ درجه بندی PCNA در بین 5 گروه تحت مطالعه وجود داشت (001/0P<) و همچنین اختلاف آماری معنی‏داری از لحاظ درجه‏بندی سلول‏های اپی‏تلیالی ضایعات، در بروز PCNA در بین انواع لکوپلاکیاها وجود داشت (001/0P<) که در لکوپلاکیا بدون دیسپلازی در رابطه با درجه بندی (+) از همه بیشتر و در لکوپلاکیا با دیسپلازی شدید از همه کمتر بود. درجه بندی (++) در لکوپلاکیا با دیسپلازی متوسط از همه بیشتر و در لکوپلاکیا با دیسپلازی  شدید از همه  کمتر  بود.  درجه بندی  (+++)  در

لکوپلاکیا با دیسپلازی شدید از همه بیشتر بود (تصویر 2).

همچنین اختلاف آماری معنی‏داری از لحاظ درجه‏بندی PCNA بین سه گروه مخاط نرمال، لکوپلاکیای بدون دیسپلازی و مجموعه لکوپلاکیاهای با دیسپلازی وجود داشت (001/0P<) (جدول 2).

با استفاده از آنالیز واریانس یک‏طرفه اختلاف آماری معنی‏داری میان 5 گروه وجود داشت (001/0P<). همچنین اختلاف آماری معنی‏داری میان انواع لکوپلاکیا وجود داشت (001/0P<) و تفاوت معنی‏داری بین بافت نرمال، لکوپلاکیا بدون دیسپلازی و مجموعه لکوپلاکیا با دیسپلازی وجود داشت (001/0P<) (جدول 3).

با توجه به آنالیز واریانس یک‏طرفه اختلاف معنی‏داری بین گروه‏های تحت مطالعه از نظر بروز P53 وجود داشت (001/0P< و 9/63F=).

بر طبق همین آزمون اختلاف معنی‏داری از لحاظ درصد بروز P53 در بین انواع لکوپلاکیا وجود داشت (001/0P< و 6/68F=). همین طور تفاوت معنی‏داری از لحاظ بروز P53 بین بافت نرمال، لکوپلاکیای بدون دیسپلازی و مجموعه لکوپلاکیا با دیسپلازی وجود داشت (001/0P< و 097/9F=).

با توجه به ضریب همبستگی اسپیرمن، P53 و PCNA با یکدیگر ارتباط مستقیم داشته و همسوی با هم عمل می‏کنند) (764/0r=) (نمودار 1).

جدول 1 : فراوانی درجه بندی تظاهر نشانگر P53 در گروه‏های تحت مطالعه بر حسب تعداد سلول‏های شمارش شده مثبت

تصویر 1 : تظاهر شدید P53 با سلولاریتی +++ در دیسپلازی شدید در تمام ضخامت اپی‏تلیوم (بزرگنمایی x100)

تصویر 2 : تظاهر شدید PCNA با سلولاریتی +++ در تمام ضخامت – دیسپلازی شدید (بزرگنمایی x100)

جدول 2 : محل بروز PCNA در گروه‏های تحت مطالعه

جدول 3 : میانگین و انحراف معیار درصد سلول‏های اپی‏تلیالی رنگ آمیزی شده با PCNA و P53

نمودار 1 : ارتباط تظاهر P53 و PCNA در ضایعات مورد مطالعه