مقدمه

از سال‏ها پیش پذیرفته شده است که میکروارگانیسم‏ها علت اصلی بیماری‏های پالپ و ایجاد ضایعات پری اپیکال هستند^(2و1)، به همین دلیل در درمان اندودنتیک سعی می‏شود به روش فیزیکی و شیمیایی میزان باکتری‏های کانال ریشه به حداقل برسد.⁽³⁾ مطالعات نشان داده اند که در آماده سازی مکانیکی بخش وسیعی از دیواره‏های کانال دست نخورده باقی می‏مانند و حذف کامل باکتری‏ها از کانال با تکیه بر آن به تنهایی امکان پذیر نمی‏باشد؛ که دلیل این امر آناتومی پیچیده‏ی سیستم کانال ریشه می‏باشد. بنابراین کاربرد محلول‏های شست و شو دهنده که اثرات ضدمیکروبی داشته باشند برای حذف بقایای پالپی و کشتن میکروارگانیسم‏ها و آماده سازی کانال لازم می‏باشد.^(5و4) با وجود قابلیت بالای ضدمیکروبی شوینده‏های رایج (هیپوکلریت سدیم و کلرهگزیدین) در مطالعات in vitro، در مطالعات کلینیکی نشان داده شده است که پس از مراحل آماده سازی و علی رغم استفاده از این محلول‏ها، هم چنان باکتری‏های زنده ای در کانال حضور دارند.

علاوه بر آناتومی پیچیده کانال‏ها و مقاومت باکتری‏ها⁽⁶⁾، یکی دیگر از دلایل عدم حذف باکتری‏ها پس از شست و شو حضور انواع مهارکننده‏های بافتی (Tissue inhibitors) در کانال‏ها می‏باشد. کانال‏های عفونی حاوی باکتری‏ها و محصولات آن‏ها، مایعات بافتی، عاج، ماتریکس عاج و بقایای بافت پالپی می‏باشند که نشان داده شده است که این محتویات باعث کاهش و یا مهار کامل اثرات ضدمیکروبی کلرهگزیدین و آیودین پتاسیم آیوداید می‏گردند.^(8و7) بخش معدنی عاج نیز به دلیل قابلیت بافرینگ، نقش مهمی به عنوان مهارکننده دارد. مشخص شده است که عاج اثرات ضدمیکروبی هیپوکلریت سدیم و Qmix را کاهش می‏دهد.⁽⁹⁾ در تحقیقی دیگر نیز نشان داده شد که هم پودر عاج و هم سلول‏های کشته شده‏ی Candida albicans باعث کاهش چشمگیر فعالیت ضدمیکروبی کلرهگزیدین می‏گردند.⁽¹⁰⁾ همچنین گزارش شده است که عاج و آلبومین سرم گاوی (Bovine serum albumine) باعث کاهش قدرت میکروب کشی کلرهگزیدین و MTAD می‏گردند.⁽¹¹⁾ بنابراین لازم است شوینده‏های جدید و استراتژی‏های ضدعفونی کننده‏ی جدید در حضور مهارکننده‏های بافتی بررسی شوند تا توانایی ضدمیکروبی آن‏ها به خوبی ارزیابی گردد.

اخیرا نانو ذرات نقره به دلیل توانایی ضدباکتریایی و ضدویروسی وسیع الطیفی که دارند در بسیاری از زمینه‏های بهداشتی مورد استفاده قرار گرفته اند.⁽¹²⁾ نانو ذرات نقره به دلیل نسبت بالای سطح به حجم و همچنین ویژگیهای منحصر به فرد فیزیکی و شیمیایی از قدرت واکنش پذیری بالایی برخوردار می‏باشند.⁽¹³⁾ مکانیسم ضدباکتریایی این نانو ذرات مربوط به چسبیدن و نفوذ انها به دیواره سلولی باکتری‏هاست که در نهایت منجر به ازدست رفتن یکپارچگی و افزایش نفوذ پذیری دیواره سلولی می‏گردد.⁽¹⁴⁾ مطالعات نشان داده اند که نانوذرات نقره از پتانسیل ضدباکتریایی بالایی بر علیه باکتری‏های گرم مثبت و منفی^(16و15) و باکتری‏های مقاوم بر خوردارند.⁽¹⁴⁾

خاصیت ضدمیکروبی قابل قبول و همچنین سازگاری بافتی به خصوص در غلظت‏های کم⁽¹⁷⁾، باعث شده است که استفاده از نانو ذرات نقره به عنوان شوینده اندودانتیک پیشنهاد گردد.

در یک مطالعه میزان تأثیر نانوپارتیکل نقره و هیپوکلریت سدیم ۲۵/۵ درصد به عنوان شوینده‏های اندودانتیک در کنترل رشد باکتری‏ها یکسان گزارش شد.⁽¹⁸⁾ همچنین تأثیر آنتی باکتریال نانوپارتیکل نقره بر بیوفیلم باکتری E.faecalis همچون هیپوکلریت سدیم ۵/۲ درصد و موثرتر از نرمال سالین و کلرهگزیدین ۱۲ درصد گزارش شده است.⁽¹⁹⁾ اخیرا نوعی نانوذره نقره دارای بار مثبت و پوشیده شده توسط ایمیدازولیوم معرفی شده است که تأثیر ضدباکتری زیادی علیه باکتری E.faecalis حتی در غلظت‏های پایین دارد. این قدرت بالای انتی باکتریال، به واکنش بار مثبت این شوینده با بار منفی غشا سلولی که منجر به افزایش لیکیج و مرگ باکتری می‏گردد نسبت داده شده است.⁽²⁰⁾ این نانوپارتیکل نقره دارای بار مثبت همراه با زنجیره‏ی ایمیدازولیوم، سازگاری بافتی بالاتری در مقایسه با کلرهگزیدین و هیپوکلریت سدیم نشان داده است.⁽²¹⁾

علیرغم اثرات ضدباکتریایی قابل قبول نانو پارتیکل‏های نقره، تا کنون مطالعه ای تأثیر انواع مهارکننده‏های بافتی را بر روی آنها بررسی نکرده است. بنابراین هدف از این مطالعه آزمایشگاهی، ارزیابی تأثیر پودر عاج، ماتریکس عاج، لیپوپلی ساکارید باکتریال و آلبومین سرم گاوی بر فعالیت ضدمیکروبی یک نوع شوینده‏ی نانوپارتیکل نقره در مقایسه با هیپوکلریت سدیم و کلرهگزیدین بود.

مواد و روش‏ها

شوینده‏ های مورد استفاده در این مطالعه‏ی پژوهشی شامل هیپوکلریت سدیم ۲۵/۵ درصد (Chloraxid, Cerkamed, Poland)، کلر هگزیدین ۲/۰ درصد (Choloraxid, Cerkamed, Poland) نانو پارتیکل نقره پوشش داده شده با ایمیدازولیوم (ساخته شده توسط دانشکده‏ی داروسازی دانشگاه علوم پزشکی شیراز) و نرمال سالین استریل بود.

ساخت محلول نانوپارتیکل نقره پوشش داده شده توسط ایمیدازولیوم در مطالعات قبلی توضیح داده شده است.⁽²⁰⁾ جهت ساخت محلول AgNPs، تمامی ظروف شیشه ای، در محلول HCL:HNO3 به نسبت ۱ به ۳ قرار داده شده و سپس ۳ بار توسط آب مقطر شسته شد. سپس 1 mL از محلول آبی M ۰۱/۰، AgNO3 به ml۲۰ محلول آبیmM  6/2 –dodecyl-3-methylimidazolium chloride1 اضافه شده و بعد از تکان دادن شدید، محلول تازه‏ی 0.4M NaBH4 توسط قطره چکان به آن اضافه گردید تا زمانی که محلولی به رنگ طلایی بدست آید. سپس برای حذف یون‏های آبی اضافه، محلول کلوئید به مدت ۲۰ دقیقه سانتریفیوژ شده و سوسپانسیون بدست آمده در دمای اتاق نگهداری گردید.⁽²⁰⁾

مهارکننده ‏های بافتی مورد استفاده در این مطالعه شامل پودر عاج، ماتریکس عاج، آلبومین سرم گاوی ۱۸ درصد (BSA)، Sigma و لیپوپلی ساکارید (LPS) بود.

جهت تهیه‏ ی پودر عاج، دندان‏های مولر کشیده شده‏ی انسان جمع آوری شده و به منظور حذف بافت‏های نرم و جلوگیری از رشد باکتری‏ها تا زمان انجام مطالعه در هیپوکلریت سدیم ۵/۰ درصد نگه داری شدند. سپس دندان‏ها با آب جاری شسته شده و اتوکلاو گردیدند. تاج دندان‏ها حذف شد و ریشه‏ها توسط فرز روند شماره ۲۱ هندپیس تراش داده شدند و پودر حاصل از این تراش جمع آوری گردید.

برای تهیه‏ ی ماتریکس عاج، مقداری از پودر عاج بدست آمده با EDTA ۱۷ درصد (Endo-Solution, Cerkamed, Poland) مخلوط گردید. از آنجایی که در این مخلوط پودر عاج ته نشین می‏شود هر روز مایع رویی تخلیه شده و با EDTA تازه جایگزین می‏شد. این کار به مدت ۵ روز تکرار شد. در روز پنجم مایع رویی خارج شده و با آب مقطر جایگزین گردید و مخلوط برای ۳ بار سانتریفیوژ گردید. ماتریکس عاج بدست آمده از عمل سانتریفیوژ تا زمان انجام آزمایش در فریزر نگه داری شد.⁽²¹⁾

باکتری E.faecalis) ATCC29212) به عنوان میکروارگانیسم مورد آزمایش در این مطالعه استفاده گردید. این باکتری بر روی آگار Brain_heart infusion (BHI) کشت داده شد و خلوص آن توسط رنگ آمیزی Gram و تست واکنش کاتالاز تایید شد. در مرحله‏ی بعد با استفاده از mL ۵ سایلین استریل، یک سوسپانسیون میکروبی تهیه شد. با استفاده از یک اسپکتروفتومتر، یک سوسپانسیون نوری با جذب نوری ۱/0 در طول موج ۶۰۰ نانومتر (معادل کدورت ۵/0 لوله مک فارلند که برابر ۵/۱×۱۰^۸ CFU /mL) تنظیم گردید.

 در سری اول آزمایش‏ها، µL ۹۵۰ از محلول‏های شوینده با µL ۵۰ از سوسپانسیون باکتریایی در یک لوله‏ی آزمایش اپندورف مخلوط گردیدند. بعد از اینکوبیشن به مدت ۱۰ثانیه، ۳۰ ثانیه و یک دقیقه، نمونه ‏های µL۱۰۰ از مخلوط مذکور برداشته شد و عمل رقیق سازی سریالی (Serial dilution) انجام شد.

µL۱۰ از هر رقت بر روی پلیت‏ های حاوی آگار BHI کشت داده شدند و در دمای c°۳۷ نگهداری شدند. بعد از ۲۴ ساعت تعداد کلونی‏ها شمارش شد.(CFU/mL) تمام آزمایش‏ها ۳ بار تکرار شد.

در سری دوم آزمایش‏ها فعالیت ضدمیکروبی شوینده‏ها در حضور مهارکننده‏ های بافتی مورد ارزیابی قرار گرفت. به این منظور mgr ۲۸ پودر عاج، mgr۵ ماتریکس عاج، mgr ۵ آلبومین سرم گاوی ۱۸ درصد و ۵ میلی گرم لیپوپلی ساکارید (1µgr/mL) در  µL۱۰۰ آب مقطر حل گردیدند. µL۱۰۰ از سوسپانسیون حاوی مهارکننده با µL ۱۰۰ از هر یک از شوینده‏ها مخلوط و به مدت ۱ ساعت انکوبه گردیدند. سپس µL ۱۰۰ از سوسپانسیون میکروبی به آن‏ها اضافه گردید طوری که حجم کلی  µL ۳۰۰ به دست آمد. در گروه کنترل منفی، سایلین استریل به جای محلول‏های شوینده مورد استفاده قرار گرفت. در گروه کنترل مثبت، از  µL۱۰۰ آب مقطر (بدون هرگونه مهار کننده ای) استفاده گردید. اینکوبیشن در یک لوله‏ی آزمایش اپندورف به مدت زمان ۱۰ ثانیه، ۱۰ دقیقه و ۱ ساعت انجام شد.

سپس بعد از مدت زمان انکوباسیون، نمونه‏های µL ۱۰۰ از سوسپانسیون‏های مورد آزمایش برداشته شد و رقیق سازی سریالی انجام شد.  µL۱۰ از هر یک از رقت‏ها بر روی پلیت‏های حاوی آگار BHI کشت داده شد و بعد از ۲۴ ساعت تعداد کلونی‏ها تشکیل شد و شمارش گردید (CFU/mL) تمام آزمایش‏ها ۳ بار تکرار گردید.

جهت آنالیز آماری از تعداد کلونی‏ها در واحد حجم (CFU/mL) لگاریتم بر پایه‏ی ۱۰ گرفته شد و سپس میانگین، میانه و انحراف معیار بدست آمد. برای انجام مقایسه‏های آماری از تست Kruskal-Wallis و تست Dunn جهت مقایسه‏های دو به دو استفاده گردید. سطح معنی‏داری معادل ۰۵/۰ در نظر گرفته شد.

یافته‏ ها

سری اول آزمایش در هر سه زمان بین محلول‏های شوینده تفاوت معنی‏داری دیده شد (۰۵/۰˂P). (جدول ۱)

مقایسه‏ی دو به دوی شوینده‏ها نشان داد که در هر سه زمان قدرت ضدمیکروبی هیپوکلریت سدیم و کلرهگزیدین بیش تر از شوینده‏ی نانوپارتیکل نقره و نرمال سایلین بود (۰۵/۰˂P). اما بین هیپوکلریت سدیم و کلرهگزیدین و هم چنین بین شوینده‏ی نانوپارتیکل نقره و نرمال سالین تفاوت آماری وجود نداشت (۰۵/۰˃P).

جدول ۱ : میانگین و انحراف معیار کلونی فرمینگ یونیت برحسب شوینده ها و زمان

در هر سه زمان ۱۰ ثانیه، ۱۰ دقیقه و ۱ ساعت مهارکننده‏ها بر توانایی ضدمیکروبی شوینده‏ها تأثیرگذار بودند (۰۵/۰˂P).

در زمان ۱۰ ثانیه در گروه هیپوکلریت سدیم، تمام مهارکننده‏ها غیر از لیپوساکارید باکتریال (1P=) بر فعالیت ضدمیکروبی اثر منفی داشتند (۰۵/۰˂P). در این زمان بیش ترین اثر مهاری بر روی هیپوکلریت سدیم مربوط به آلبومین بودکه با سایر مهارکننده‏ها غیر از عاج )۳۷۵/۰(P= تفاوت آماری داشت (۰۵/۰˂P).

در گروه کلرهگزیدین تمام مهارکننده‏ها در مقایسه با گروه کنترل فعالیت ضدمیکروبی را کاهش دادند (۰۵/۰˂P). در همین زمان بیش ترین اثر مهاری بر روی کلرهگزیدین مربوط به لیپوساکارید بود که با سایر گروه‏ها تفاوت معنی‏داری داشت (۰۵/۰˂P).

در این زمان گروه‏های نانوپارتیکل نقره و سالین صرف نظر از حضور یا عدم حضور مهارکننده‏ها، رشد زیاد باکتری‏ها را نشان دادند (۰۵/۰˃P). (جدول 2)

برای هیپوکلریت سدیم بعداز ۱۰دقیقه تماس با آلبومین و عاج، در مقایسه با گروه کنترل اثر مهاری داشتند (۰۵/۰˂P). در حالی که لیپوساکارید و ماتریکس عاج این اثر را نداشتند (۰۵/۰˃P).

بیش ترین اثر مهاری برای هیپوکلریت سدیم مربوط به آلبومین بود که با سایر گروه‏ها غیر از عاج )۳۷۵/۰(P= تفاوت داشت (۰۵/۰˂P).

در این زمان در گروه، کلرهگزیدین، لیپوساکارید و آلبومین با گروه کنترل تفاوت داشتند (۰۵/۰˂P). بیش ترین اثر مهاری مربوط به لیپوساکارید بود که با تمام گروه‏ها غیر از آلبومین (P=1) تفاوت داشت (۰۵/۰˂P). مجدداً در این زمان گروه‏های نانوپارتیکل نقره و نرمال سالین صرف نظر از حضور یا عدم حضور مهارکننده‏ها رشد بالای باکتری‏ها را نشان دادند (۰۵/۰˃P). (جدول3)

در گروه هیپوکلریت سدیم، آلبومین و ماتریکس عاج اثر مهاری داشتند (۰۵/۰˂P). اما لیپوساکارید و عاج اثر مهاری نداشتند (۰۵/۰˃P).

در این زمان بیش ترین اثر مهاری مربوط به آلبومین بود که با سایر گروه‏ها غیر ماتریکس عاج (126/0P=) تفاوت داشت (۰۵/۰˂P).

در گروه کلرهگزیدین تمام مهارکننده‏ها غیر از عاج (1P=) اثر مهاری نشان دادند (۰۵/۰˂P).

بیشترین اثر مهاری مربوط به Lps بود که از سایر گروه‏ها به طور معنی‏داری بیش تر بود (۰۵/۰˂P)، اما با آلبومین تفاوتی نداشت (1P=).

مجدداً در این زمان نیز گروه‏های نانوپارتیکل نقره و نرمال سالین صرف نظر از حضور یا عدم حضور شوینده، رشد بالای باکتری‏ها را نشان دادند (۰۵/۰˃P). (جدول 4)

جدول 2 : میانگین و انحراف معیار کلونی فرمینگ یونیت برحسب مهارکننده‏ ها بر

فعالیت ضدمیکروبی شوینده‏ ها و گروه در زمان ۱۰ ثانیه

جدول 3 : میانگین و انحراف معیار کلونی فرمینگ یونیت برحسب مهارکننده‏ ها بر

فعالیت ضدمیکروبی شوینده ‏ها و گروه در زمان ۱۰ دقیقه

جدول 4 : میانگین و انحراف معیار کلونی فرمینگ یونیت بر حسب تأثیر مهارکننده ‏ها بر

فعالیت ضدمیکروبی شوینده ‏ها و گروه در زمان ۱ ساعت