مقدمه

دانش بالینی و پیشرفت تکنولوژی در سال‎های اخیر کمک بسیار شایانی به موفقیت روش های کمک باروری بویژه IVF نموده است. اما همچنان یکی از عوامل بسیار مهم موفقیت در این زمینه تعداد اووسیت های تولید شده توسط تخمدان به دنبال تحریک هورمونی است (1). به بیانی دیگر یکی از عوامل محدود کننده مهم در موفقیت IVF پاسخ تخمدانی ضعیف می باشد که در 10 تا 15 % زنانی که تحت عمل IVF قرار می گیرند مشاهده شده است (2). بنابراین بررسی رزرو تخمدانی قبل از انجام درمان های کمک باروری امری ضروری است (3). رزرو تخمدانی به عنوان پتانسیل عملکرد تخمدان، منعکس کننده‎ی کمیت و کیفیت تخمک های درون یک تخمدان می باشد (4).

با پیشرفت طب باروری امروزه بخش بزرگی از پژوهش ها بر روی بررسی رزرو تخمدانی متمرکز شده اند. این پژوهش ها به طورکلی با اهداف : 1- بهبود ایمنی روش های تحریک تخمدان از طریق شناسایی بیماران با پاسخگویی بالا (که در معرض خطر بالاتر OHSS هستند) 2- بهبود کارآمدی روش های تحریک تخمدان( از طریق تطبیق دوز تحریک) و 3- استفاده از رزرو تخمدانی به عنوان ابزاری برای پیشگویی پیامد روش درمانی IVF انجام می گردند. از این رو می توان گفت شناسایی زنان جوان با رزرو تخمدانی پایین که در واقع در شرایطی مشابه با زنان مسن پره منوپوز به سر می برند و آگاهی دادن به آنها در مورد این مسئله به عنوان یک نیاز بالینی حائز اهمیت ویژه‎ای است (4).

دستیابی به نتایج رضایت بخش در روش های کمک باروری مستلزم ارزیابی دقیق بیمار  و بررسی رزرو تخمدانی اوست (5).  یک آزمون رزرو تخمدانی مناسب باید بتواند در یک جمعیت نابارور که برای که برای درمان باروری مراجعه می نمایند شانس بارداری و تولد نوزاد زنده را پیشگویی نموده و دوز اوپتیموم هورمونی را که برای تحریک تخمدان انتخاب شده تعیین نماید (6).

برخی از مطالعات سنجش حجم تخمدان و فولیکول های آنترال  را به عنوان آزمون های مفیدی در تعیین رزرو تخمدانی معرفی کرده اند.  از دیگر آزمون های بررسی رزرو تخمدانی می توان به تعیین سطوحFSH (follicle-stimulating hormone) ، سطوح سرمی inhibin B و antral follicle count (AFC) اشاره نمود (4، 7-10).

 یکی از هورمون هایی که اخیرا به عنوان مارکری برای پیش بینی پاسخ تخمدانی قبل از به کارگیری روش های کمک باروری مورد توجه قرار گرفته است AMH می باشد(11-13). این هورمون توسط سلولهای گرانولوزای تخمدانی تولید شده و بعد از بلوغ میزان آن با سرعتی آهسته شروع به کاهش نموده و در زمان منوپوز از بین می رود(5). از جمله عملکردهای این هورمون مهار به کارگیری فولیکول اولیه ، مهار رشد وابسته به FSH و انتخاب فولیکولهای پری ناتال و فولیکولهای کوچک آنترال می باشد(14). از آنجایی که سطوح سرمی AMH با تعداد فولیکولهای آنترال اولیه مرتبط می باشد لذا این هورمون می تواند برای ارزیابی پتانسیل باروری و پاسخ تخمدانی در IVF مورد استفاده قرار گیرد(5). بر اساس مطالعه ای در حال حاضر آزمون ایده آل برای تعیین رزرو تخمدانی، سنجش سطح AMH می باشد که از نظر مقدار حساسیت و ویژگی با AFC همتراز ولی از FSH، استرادیول، LH و inhibin-B بهتر می باشد (15). FSH ، inhibin-B و استرادیول در مراحل اولیه ی کاهش رزرو تخمدانی حساسیت پایینی دارند. این سه هورمون بخشی از یک سیستم بازخورد بوده و سطح سرمی آنها مستقل از یکدیگر نیست. علاوه بر این تغییرات سرمی این سه هورمون در فرآیند reproductive aging نسبتا دیر و در زمانی که رزرو تخمدانی به حدی بحرانی رسیده و شانس باردار شدن به طور معنی داری کاهش پیدا نموده اتفاق می افتد (16). اما سطح سرمی AMH مستقل از سیکل قاعدگی بوده و از آگونیست های GnRH و یا کنتراسپتیوهای خوراکی متاثر نیست(17). با وجود آنکه در حال حاضر AMH به عنوان یک مارکر قابل اطمینان و نوید بخش در پیشگویی پاسخ تخمدانی قبل از به کارگیری روش های کمک باروری شناخته شده است اما سطوح cut-off این هورمون برای تعیین حداقل و حداکثر پاسخ تخمدانی همچنان مورد بحث بوده و در مطالعات مختلف مقادیر مختلفی گزارش شده است. با توجه به اینکه تعیین نقطه برش مناسب این هورمون در رابطه با پیش‌بینی پاسخ‌های تخمدانی می‌تواند نقش بسیار مهمی در تصمیم گیری های بالینی مهم و حیاتی برای زنان نابارور داشته باشد. این مطالعه با هدف پیش‌بینی پاسخ‌های تخمدانی بیش از حد با استفاده از سطوح AMH بر روی افراد کاندید IVF انجام شده است.

روش‌ کار

در این مطالعه که به صورت آینده‌نگر انجام شده است، کلیه بیماران نازای مراجعه کننده به درمانگاه نازایی بیمارستان مهدیه از ابتدای سال 1390 تا پایان سال 1391 در صورت داشته بودن معیارهای الف. نداشتن بیماری اندوکرین زمینه‌ای ب. عدم مصرف داروهای هورمونی طی 3 ماه گذشته ج. عدم تشخیص (Polycystic ovary syndrome) PCO  بر اساس کرایتریای روتردام و عدم تشخیص ازوسپرمی یا severe oligozoospermia وارد مطالعه شدند. برای  کلیه بیماران نازای مراجعه کننده به درمانگاه نازایی بیمارستان مهدیه شرایط ورود به مطالعه را دارا بوده و کاندید IVF بوده‌اند، سطوحAMH(ELIZA, mg/ml) ،  FSH(RIA, iu/ml) و E2(ECL pg/ml)  در روز 2 یا 3 سیکل سنجیده  شد. تمام بیماران در حداقل یک ماه قبل تحت درمان هورمونی قرار نگرفته بودند. در مرحله بعد بیماران وارد سیکل درمان استاندارد طولانی مدت با آنتاگونیست GnRH(sinafact ,sinagen) شدند، در مرحله بعدی و در ابتدای سیکل قاعدگی (روز 1 تا 3) برای افراد وارد شده در مطالعه، سونوگرافی پایه برای اطمینان از عدم وجود پاتولوژی زمینه‌ای صورت گرفت. در این مطالعه تحریک کنترل شده‌ی تخمک گذاری از روز 4-3 سیکل آغاز شده و دز مورد نیاز HMG  از نوع انسانی- ادراری (Merional-IBSA-75 IU/ml Amp) برطبق پروتکل تصویب شده در بخش نازایی بیمارستان مهدیه تهران بر اساس سن بیمار  تعیین و  آغاز می‌شد. هر3-4 روز سونوگرافی کنترل انجام شده و بر اساس پاسخدهی تخمدان درمان ادامه یافته و مجددا سونوگرافی کنترل 2 تا 3 روز بعد انجام می‌گرفت. با مشاهده فولیکول غالب سایز (16-18mm) مداخله نهایی به صورت تزریق HCG (10000 iu  choriomon IBSA انجام شده  و 35-36 ساعت بعد برداشت اووسیت ها انجام گرفته و در اختیار جنین شناس  قرار داده می‌شد. در صورت مناسب بودن جنین برای انتقال 48-36 ساعت بعد انتقال جنین صورت می‌گرفت. از روز برداشت اووسیت حمایت فاز لوتئال با پروژسترون واژینال(سیکلوژست 400، actover) آغاز شده و در صورت بارداری تا هفته 10 بارداری ادامه می یافت. نتایج کلیه سونوگرافی‌ها و آزمایشات و پاسخدهی تخمدانی هر بیمار و دز داروی مصرفی در هر سیکل در پرونده بیماران ثبت می‌شد. بیماران بر اساس  تعداد اووسیتها و جنین در سه گروه با پاسخ تخمدانی ناکافی (کمتر یا مساوی 3 اووسیت)، پاسخ تخمدانی  مناسب ( 12- 4 اووسیت )   و پاسخ تخمدانی بیش از حد( 12> اووسیت) طبقه‌بندی شدند.

آنالیز آماری

داده‌های دموگرافیک و بالینی پایه پیوسته به صورت میانگین± انحراف معیار و داده‌های گروه‌بندی شده به صورت فراوانی و درصد نمایش داده شدند. برای بررسی استقلال دو متغیر Categorical از آزمون کای دو یا Fisher’s exact  استفاده شد. برای بررسی اختلاف میانگین بین پاسخ‌های تخمدانی مختلف از آنالیز واریانس یک طرفه و آزمون متعاقب توکی استفاده شده است. برای بررسی همبستگی متغیرهای مورد بررسی با پیامد و دیگر متغیرهای مستقل، از ضریب همبستگی پیرسون استفاده شده است. با توجه به اینکه توزیع غلظت  AMH در ابتدا نرمال نبود با تغییر Scale  به لگاریتم طبیعی این عمل انجام شد. در مرحله بعد و قبل برازش مدل مناسب برای محاسبه سطح زیر منحنی مربوط به متغیر پیشگویی کننده ابتدا نوع ارتباط (خطی یا غیر خطی بودن) و Scale مناسب آن، با استفاده از روش‌های(locally weighted scatter plot smoothing)  Lowess Smoother   و (Fractional polynomial regression) Fracpoly تعیین و سپس برای ترسیم نمودار ROC از مدل متناسب با برازش داده‌ها استفاده ‌شده است. نتایج مدل Fracpoly با مقایسه کردن مدل‌های مختلف در هر سه مدل رگرسیون چندگانه اسمی، رتبه‌ای و Negative binomial نشان داد که در هر سه مدل توان 5/0 یا Scale لگاریتم طبیعی AMH بهترین حالت برای برازش این مدل‌ها می‌باشد. توجه به ماهیت پیوسته غلظت هورمون AMH در سرم و معایب ذکر شده برای Categorical کردن داده‌های پیوسته، از این مدل‌ها استفاده شد. جزییات مرتبط با این مدل‌ها قبلا منتشر شده است(18-20). برای تعیین اثرگذاری AMH بر فرایند تحریک تخمدانی و پاسخ‌های تخمدانی مختلف با تطبیق متغیرهای همراه از مدل‌های رگرسیونی چندگانه اسمی، رتبه‌ای و Negative binomial با در نظر گرفتن معیار  Over dispersionاستفاده شده است. کلیه مدل‌های بالا به روش Backward Stepwise برازش شده‌اند. معیار در نظر گرفتن بهترین مدل، AIC این مدل‌ها بوده است. نکته قابل توجه اینکه در مدل‌های رگرسیونی چند حالته اسمی و رتبه‌ای متغیر پاسخ، پاسخ‌های مختلف تخمدانی (No response، Poor response، Normal response و Excessive response) بوده ولی در مدل nbreg متغیر پاسخ تعداد تخمک‌های آزاد شده در طول دوره می‌باشند. جزئیات مرتبط با این مدل‌ها قبلا منتشر شده است (21-22). برای تعیین بهترین نقطه برش، سطح زیر منحنی، ارزش اخباری مثبت و منفی و همچنین حدود اطمینان برای هر یک از مقادیر ذکر شده، با استفاده از نرم افزار  R i386 3.0.2 استفاده شده است. پروپوزال این پژوهش در کمیته اخلاق دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی به تصویب رسیده است.

نتایج

در این مطالعه از اطلاعات 188 نفر از مجموع، 193 نفر مراجعه کننده کاندید IVF به بیمارستان مهدیه تهران استفاده شده است. در این مطالعه ابتدا اطلاعات پایه افراد مورد بررسی را در جدول 1 مورد بررسی قرار می‌دهیم و در مراحل بعد از آنالیز تک متغیره به چند متغیره و تعیین نقطه برش مناسب برای پیش‌بینی سطح AMH در ارتباط با فرم‌های مختلف پاسخ تخمدانی خواهیم پرداخت. نتایج آنالیز واریانس یک طرفه نشان می‌دهد که میانگین سطح خونی هورمون AMH در گروه‌های مختلف پاسخ تخمدانی (عدم پاسخ، پاسخ ضعیف یا Poor، پاسخ نرمال و پاسخ بیش از حد) متفاوت است (001/0< p‌,‌36/8F=). نتایج در این مطالعه نشان می‌دهند که 8/7 % (15 نفر)، دارای عدم پاسخ تخمدانی به درمان، 4/11 % (22 نفر) پاسخ Poor، 8/50 % پاسخ نرمال (98 نفر) و بقیه دارای پاسخ بیش از حد تخمدانی بوده‌اند. نتایج آنالیز متعاقب توکی و سایر اطلاعات پایه افراد مورد بررسی بر حسب نوع پاسخ تخمدانی در جدول 1 خلاصه شده است.

همانگونه که جدول 1 نشان می‌دهد به کار گیری هورمون AMH برای تحریک تخمدانی در این مطالعه باعث مثبت شدن تست β-hCG و یا به عبارتی 1/30 بارداری موفق شده است. نتایج آنالیز کای‌دو نشان می‌دهد که بین پاسخ‌های مختلف تخمدانی و مثبت شدن تست حاملگی ارتباط معنی‌دار آماری وجود ندارد(071/0p=). نتایج آنالیز همبستگی پیرسون نشان می‌دهد که بین غلظت هورمون AMH و تعداد تخمک‌های آزاد شده (پاسخ تخمدانی) یک رابطه مستقیم و قوی وجود دارد(401/0=Pearson correlation و 001/0< p).

همچنین در بررسی همبستگی بین غلظت همورمون FSH و پاسخ تخمدانی افراد مورد بررسی مشخص شد که این ارتباط از نوع معکوس بوده است و این یعنی اینکه با بالاتر رفتن غلظت هورمون FSH پاسخ تخمدانی کمتر می‌شود(245/0- = Pearson correlation و 001/0=p)، که این یافته با نگاه کردن به اعداد مندرج در جدول 1، قابل مشاهده می‌باشد.

برای بررسی اثر سطوح مختلف هورمون AMH بر پیامد پاسخ تخمدانی از سه مدل متفاوت رگرسیونیMultinominal, Ordinal و Negative binomial با در نظر گرفتن معیار Overdispersion استفاده شده است.  برای بررسی شکل ارتباط (Shape of association) بین متغیر مستقل (در این مطالعه AMH) و پیامد، و همچنین Scale مناسب متغیرهای پیوسته از روشregression  Fractional polynomial   استفاده شده است. این مدل نشان می‌دهد که استفاده از Scale لگاریتم هورمون AMH در هر سه مدل دارای کمترین AIC در بین مدل‌های مورد بررسی است.

جدول 2 اثرات غلظت های مختلف هورمون AMH در خون را بر نوع پاسخ تخمدانی  را برای مدل‌ رگرسیون چند حالته اسمی نشان می‌دهد. کلیه مدل‌ها بر اساس Backward stepwise method برازش شده اند.

نکته قابل توجه اینکه در مدل Ordinal  متغیر پاسخ به صورت عدم پاسخ، پاسخ Poor، پاسخ نرمال و پاسخ بیش از حد تخمدان تعریف شده‌اند. در خصوص رگرسیون چند حالته اسمی نیز این پاسخ‌ها به صورت اسمی در نظر گرفته شده‌اند. برای مدل Negative binomial نیز متغیر پاسخ تعداد تخمک‌های آزاد شده در طی مطالعه مد نظر قرار گرفته شده است. 

نتایج این مدل با قرار دادن پاسخ نرمال به عنوان طبقه مرجع و استفاده از معیار AIC برای برازش بهترین مدل، گزارش شده است. نتایج نشان می‌دهند که با افزایش هر واحد در لگاریتم هورمون AMH شانس داشتن پاسخ Poor نسبت به داشتن پاسخ نرمال 64 % کاهش می‌یابد، همچنین باید گفت که در صورت افزایش هر واحد در لگاریتم AMH، این مقدار برای گروه پاسخ بیش از اندازه نسبت به گروه نرمال 71 % بیشتر خواهد شد.

نتایج حاصل از مدل رگرسیونی با شانس‌های متناسب با کنترل متغیرهای دیگر نیز نشان می‌دهد که شانس قرار گرفتن افراد در هر یک طبقات از پاسخ‌های تخمدانی متفاوت (عدم پاسخ، پاسخ Poor، پاسخ نرمال و پاسخ بیش از اندازه)  نسبت به طبقات ماقبل یا بعد آن، برابر با 29/2 خواهد بود(001/0< p , 19/64-3/1:CI 95% , 29/2=OR).

با قرار دادن تعداد تخمک‌های آزاد شده بعد از تحریک به وسیله هورمون AMH به عنوان متغیر پاسخ، نتایج مدل Negative binomial regression نشان می‌دهد که به ازای یک واحد افزایش در لگاریتم سطح خونی هورمون AMH، شانس آزادسازی یک تخمک 24 % افزایش خواهد داشت(35/1 – 14/1 :CI 95% , 24/1=OR). نکته قابل توجه اینکه در تمامی مدل‌های برازش شده متغیر سن مادر به عنوان یکی از متغیرهای تاثیر گذار بر نتایج مطالعه بوده است. برای مثال نتایج به دست آمده در جدول 2 نشان می‌دهند که با افزایش یک واحد در سن مادر شانس داشتن ضعیف 33/1 برابر شانس داشتن پاسخ نرمال خواهد بود. همچنین در مدل nbreg، با افزایش هر واحد به سن مادر شانس آزادسازی هر تخمک، در افرادی مورد بررسی 4 % کاهش پیدا می‌کند(99/0- 93/0 :CI 95% , 96/0=OR) همچنین نتایج نشان می‌دهند که تنها متغیر اثر گذار بر تعداد جنین‌های تشکیل شده در طی مراحل درمانی ارتباط مستقیمی با سطوح هورمونی AM و ارتباط معکوسی با سن مادر در زمان درمان نازایی دارد. این یافته‌ها نشان می‌دهد که با افزایش هر واحد در غلظت هورمون AM، شانس تشکیل یک جنین تقریبا 3/0 % افزایش می‌یابد (04/1- 01/1:CI 95% , 025/1=OR)، همچنین با بلاتر رفتن سن مادر به ازای هر یک سال شانس تشکیل یک جنین تقریبا 2 % کاهش پیدا می‌کند (99/0- 96/0:CI 95% , 98/0=OR).

در مرحله بعد به بررسی نقاط برش مناسب برای پیش‌بینی پاسخ‌های تخمدانی ضعیف، بیش از حد و عدم پاسخ در مقایسه با پاسخ نرمال پرداخته می‌شود.  شکل 1 ارتباط سطح خونی AMH و پاسخ‌های تخمدانی ضعیف و بیش از حد را نشان می‌دهد.